高三生物选修一果酒、果醋、泡菜的制作，DNA的粗提取、PCR技术课件

果酒和果醋的制作一、制作果酒果醋的微生物： 酵母菌——真菌 醋酸菌——细菌 二、两种微生物的分类地位 1.制作果酒——酵母菌 2.制作果醋——醋酸菌菌种 名称 生物学 分类 代谢 类型 适宜 温度 繁殖方 式 对氧的需求 酵母菌 真核生 物 异养 兼性厌氧 最适 20℃ 出芽生 殖 前期需氧， 后期不需氧 醋酸菌 原核生 物 异养 需氧 30— 35℃ 二分裂 一直需氧 控制空气的一些措施控制空气的一些措施三、繁殖方式和代谢类型 出出 芽芽 生生 殖殖 二二 分分 裂裂 生生 殖殖比较 果酒制作 果醋制作 制作 原理 酵母菌先在有 氧条件下大量繁殖， 再在无氧条件下进 行酒精发酵 醋酸菌在氧气、 糖源充足时,将糖分解 成醋酸； 当缺少糖源时， 将乙醇变为乙醛，再 将乙醛变为醋酸 四、制作原理和发酵条件的比较制作果酒制作果酒 制作果醋制作果醋 最适发最适发 酵温度酵温度 18℃18℃————25℃25℃ 30℃30℃————35℃35℃ 对氧对氧 的需求的需求 前期：需氧前期：需氧 后期：不需氧后期：不需氧 需充足氧需充足氧 pHpH 酸性环境酸性环境 （3.3~3.5） 酸性环境酸性环境 （5.4~6.3） 发酵时间发酵时间 1010————12 d12 d 77———— 8 d 8 dC6H12O6+6O2+6H2O → 6CO2+12H2O+能量酶 1、有氧呼吸： C6H12O6 →2C2H5OH+2 CO2+能量酶 2、无氧呼吸： 酵母菌 制酒 ㈠制作果酒（前期需氧，后期厌氧） 出芽生殖，出芽生殖， 增加酵母菌数量增加酵母菌数量 产生酒精产生酒精1、若氧气、糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖 分解成醋酸，其反应式： 酶 C6H12O6 →3CH3COOH（醋酸） 2、若缺少糖源，氧气不足时，醋酸菌将乙醇变为 乙醛，再将乙醛变为醋酸，其反应式： 酶 2C2H5OH+O2 →2CH3CHO（乙醛）+2H2O 酶 2CH3CHO+O2 →2CH3COOH（醋酸） 醋酸菌 制醋 ㈡制作果醋（一直需要氧） 五、实验流程示意图1、材料的选择与处理 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗， 除去枝梗。 ①、取葡萄500g，去除枝梗和腐烂的叶子。 ②、用清水冲洗葡萄1－2次除去污物。 讨论：你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？ 为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去 枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会 六、实验操作2、清洗（WHY？） 3、榨汁 将冲洗除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。 4、发酵：发酵装置如下 5、注意事项 ①将葡萄汁装人发酵瓶， 要留大约1／3的空间 (如图右图所示)，并封 闭充气口。（为什么？） 塑料瓶中不能装满葡萄液汁，应留一定空间， 有利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖形成种群优势。 防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染 70%70%酒精消毒酒精消毒③制葡萄醋的过程中，要适时通过充气口充气。 将温度严格控制在30℃～35℃， 时间控制在前7～8d左右。 ②制葡萄酒的过程中，要严格密闭， 将温度严格控制在18℃～25℃， 时间控制在10～12d左右，可通过出料口对发酵 的情况进行。及时的监测。 专题1:传统发酵技术的应用一、乳酸菌 乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类 细菌的总称。 属于原核生物 乳酸菌种类多，分布广，常见乳酸菌有乳 酸链球菌和乳酸杆菌（用于制酸奶）。 乳酸链球菌（球状） 乳酸杆菌（杆状）分布：在自然界分布广泛，空气、土壤、植 物体表、人或动物肠道内部都有 繁殖：以二分裂方式进行繁殖（无性生殖） 代谢类型： 异养厌氧型 C6H12O6 2C3H6O3+能量酶 乳酸菌耐盐，最适pH=5，为发酵中的先锋队为什么含有抗生素的牛奶不能发酵为酸奶？ 牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的发酵 作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。二、亚硝酸盐 自然界中，亚硝酸盐分布广泛，蔬菜、咸菜、 豆粉中均含有。 亚硝酸盐为白色粉末，外观与食盐相似，有 咸味，易溶于水，可作食品添加剂。 亚硝酸盐为强氧化剂，能够把血液中携带氧的 低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而导致缺氧 性中毒症状。 膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但 是，当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3～0.5g时， 会引起中毒，当摄入总量达到3g时，会引起死亡。 膳食中的绝大部分亚硝酸盐随尿排出，只 有在特定的条件下才会转变成致癌物――亚硝胺， 亚硝胺对动物还具有致畸和致突变作用（亚硝酸盐 本身不是致癌物质）。 亚硝酸盐在pH=3，温度适宜和一定微生物的 作用下转变成致癌物质亚硝胺，因此，霉变的食 品亚硝胺可增至数十倍至数百倍。 我国卫生标准规定：亚硝酸盐的残留量 在肉制品中不得超过30mg/kg， 酱菜中不超过20mg/kg， 而婴儿奶粉中不得超过2mg/kg。选泡菜坛 预处理新鲜蔬菜 配置盐水 装坛发酵 成品泡菜 测定亚硝酸盐含量检查方法：坛口向上， 压入水中，看坛内壁有 无渗水现象。 无裂纹、无砂眼 坛沿深、盖子 吻合好 火 候 好蔬菜处理 将鲜菜修整、洗涤、阳光下晾晒，到菜表皮 萎焉时收下，切分成条状或片状。配制盐水 • 清水与盐按4:1的比例配制好后煮沸冷却。 盐的作用：调味，抑制微生物生长，所以盐含量 过低会造成细菌污染。 煮沸的目的：杀菌 冷却是为了不影响乳酸菌的生命活动。装坛发酵 • 将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。 • 将经过处理的蔬菜混合均匀，装入泡菜坛内， 装至半坛时放入蒜瓣、生姜及其他香辛料， 继续装至八成满，再徐徐注入配好的盐水， 使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。向坛盖边 缘的水槽中注满水。并注意发酵过程中补充 水。 坛沿注满水是为了保证坛内乳酸菌的发酵所需的无 氧环境。腌制条件 • 温度不能过高 • 食盐含量不能过低 • 腌制时间不能过短 细菌污染大量繁殖后，亚硝酸盐含量增加 腌制过程中，亚硝酸盐含量先增多，后减少。泡菜发酵的阶段 • 泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，发 酵产物乳酸不断累积，因此可以根据微生物的 活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为 三个阶段。 蔬菜蔬菜刚入坛刚入坛时，时，蔬菜表面带入的微生物蔬菜表面带入的微生物，主要是以不，主要是以不 抗酸的抗酸的大肠杆菌大肠杆菌和和酵母菌酵母菌等较为活跃，它们产生较多的等较为活跃，它们产生较多的 乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水 槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。 发发酵酵产产物物中中除除乳乳酸酸外外，，还还有有其其他他，，如如乙乙醇醇、、COCO22等等称称 异型乳酸发酵异型乳酸发酵 发酵前期： 特点：还有一点点氧气，微生物（大肠杆菌，酵 母菌）发酵，产生代谢产物，二氧化碳排出，形 成无氧环境，为后面乳酸菌发酵提供条件，乳酸 含量逐渐增加，抑制微生物生长繁殖。 由于由于前期前期乳酸的积累乳酸的积累，，pHpH下降下降，，嫌气状态嫌气状态的形成，的形成，乳乳 酸杆菌酸杆菌进行活跃的进行活跃的同型乳酸发酵同型乳酸发酵，乳酸的积累量可达到，乳酸的积累量可达到 0.6%0.6%～～0.8%0.8%；乳酸积累；乳酸积累pHpH达达3.53.5~~3.8.3.8.大肠杆菌、酵母菌、大肠杆菌、酵母菌、 霉菌等的活动受到抑制。这一期为霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段完全成熟阶段，泡菜，泡菜 有酸味且清香有酸味且清香品质最好品质最好。。 发酵产物发酵产物中中只有乳酸只有乳酸，称为同型乳酸发酵，称为同型乳酸发酵 发酵中期： 特点:乳酸菌逐渐占据优势，其他发酵微生物受 到抑制，乳酸积累增多 在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续 增加，可达增加，可达1.0%1.0%以上。当以上。当乳酸积累乳酸积累达达1.21.2％以上％以上时，时，乳酸乳酸 杆菌的活性受到抑制杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。，发酵速度逐渐变缓甚至停止。 发酵后期： 此阶段泡菜酸度过高、风味不协调。 特点：乳酸含量过高，抑制乳酸菌活动，乳酸 菌减少。 1、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这 层白膜是怎么形成的？ 形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌 是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其 表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。 2、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不 吃存放时间过长、变质的蔬菜？ 有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸 盐。当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、腐 烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会 被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。四、亚硝酸盐含量的测定1、测定亚硝酸盐含量的原理 比色法 在在盐酸酸化条件下盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸发生发生重重 氮化氮化反应后，再与反应后，再与N-1N-1－萘基乙二胺盐酸盐－萘基乙二胺盐酸盐结合生成结合生成玫瑰玫瑰 红红溶液。溶液。 将经过反应显色后的泡菜待测样品与标准液比 色，即可估算出样品中的亚硝酸盐含量。3、步骤 （1）配置溶液 （2） 配制标准液 （3） 制备泡菜样品处理液 （4）比色2、材料与器具 泡菜、 对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸盐、盐酸 亚硝酸钠、 氯化镉、氯化钡、 氢氧化钠、氢氧化铝、 蒸馏水、 榨汁机、移液管、容量瓶、比色管等（1）配置溶液 对氨基苯磺酸溶液(4mg/mL)溶于盐酸，避光保存 N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液(2mg/mL) 避光保存 亚硝酸钠溶液(5ug/mL) 提取剂：氯化镉、氯化钡氯化镉、氯化钡 氢氧化铝乳液 氢氧化钠溶液（2） 配制标准显色液 用移液管吸取用移液管吸取0.20mL0.20mL、、0.40mL0.40mL、、0.60mL0.60mL、、0.80mL0.80mL、、 1.00mL1.00mL、、1.50mL1.50mL亚硝酸钠亚硝酸钠溶液溶液((相当于相当于11ugug，，2ug2ug，，3ug3ug ，，4ug4ug，，5ug5ug和和7.5ug7.5ug亚硝酸钠亚硝酸钠))，分别置于，分别置于50mL50mL比色管比色管中，中， 再取再取11支比色管作为支比色管作为空白对照空白对照。。 并分别加入并分别加入2.0mL2.0mL对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置，混匀，静置33～～ 55分钟后；分钟后； 再分别加入再分别加入1.0mL 1.0mL N-1N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液－萘基乙二胺盐酸盐溶液，加，加 蒸馏水至蒸馏水至50mL50mL，混匀；，混匀； 观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（玫瑰红色玫瑰红色逐渐加逐渐加 深）。深）。制备样品 样品处理液的制备 增加亚硝酸盐的 溶解度 中和乳酸 吸附杂质，脱色， 净化作用比色 样品即滤液加入比色管 显色反应：先加对氨基苯磺酸 ，后加 N-1－萘基乙二胺盐酸盐 比色：显色后与标准显色液对比，找出颜色 最相近的记录对应亚硝酸盐含量测定反应原理总结 酸化：对氨基苯磺酸溶于对氨基苯磺酸溶于盐酸中盐酸中 重氮化：亚硝酸盐亚硝酸盐++对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸 重氮盐重氮盐 酸 显色：重氮盐+ N-1N-1－萘基乙二胺盐酸盐－萘基乙二胺盐酸盐 比色：样品和标准比色液对比，估算亚硝酸盐含量 ① ② ③ 玫瑰红色基本 知识 实验 设计 乳酸菌发酵 定义 分类 分布 亚硝酸盐 操作提示 泡菜坛选择 腌制条件 泡 菜 的 制 作 及 亚 硝 盐 检 测 发酵原理 乳酸杆菌 乳酸链球 菌 葡萄糖 乳酸 国家标准 危害 泡菜制作 亚硝酸盐含量测定 时间、温度、食盐用量、微生物 测定亚硝酸盐含量的操作 结果分析与评价 课堂小结果酒果酒 果醋果醋 泡菜泡菜 微生物类微生物类 型型 原理原理 反应条件反应条件 检测方法检测方法 酵母菌， 真菌，兼 性厌氧 醋酸菌， 细菌，好 氧菌 乳酸菌，细 菌，厌氧菌 酵母菌的 无氧呼吸 产生酒精 18~25 ℃ ，无氧 重铬酸钾 与其反应 呈灰绿色 醋酸菌的 有氧呼吸 产生醋酸 30~35 ℃，通 入氧气 品尝、 pH试纸检 测 乳酸菌无 氧呼吸产 生乳酸 常温，无 氧条件 pH检测，亚 硝酸盐的检 测方法 某学生把甘蓝切丝后制作泡菜，为了探究甘蓝在不 同的温度下经过3天发酵后所生成的乳酸量，在第4天检 测的实验结果如表： (1)分析资料，你可以得出什么结论? (2)在泡菜制作时，乳酸含量大致在0.8％左右时风味最 好，此时维生素C的保存率也较高，结合以上材料，你 在制作泡菜时应该注意什么? 练习题(1)分析资料，你可以得出什么结论? 从表中数据分析可得知，甘蓝在31℃时所生成 的乳酸含量最多，低于或者高于这个温度所生成的 乳酸量都比较少一些。(2)在泡菜制作时，乳酸含量大致在0.8％左右时风 味最好，此时维生素C的保存率也较高，结合以上 材料，你在制作泡菜时应该注意什么? 注意把温度控制在16℃左右为宜2001年1月4日 （封坛前） 2001年1月8日 2001年1月12日 2001年1月15日 2001年1月19日 0.15  0.60 0.20 0.10 0.10 1号坛 2号坛 0.15  0.20 0.10 0.05 0.05 3号坛 0.15  0.80 0.60 0.20 0.20 泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化 4、实验结果分析和讨论选录 三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数量 虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同。在腌 制后的第五天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的含量都 达到最高峰（1、2、3号坛中的亚硝酸盐分别达 到 0.6mg/kg、0.2mg/kg、0.8mg/kg） 在腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就 可以达到最高峰。而第9天后泡菜中的亚硝酸盐含 量开始有明显下降。 这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环 境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌） ，这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。 但随着腌制时间的延长，乳酸菌也大量繁殖， 对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁 殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下 降。DNA的粗提取与鉴定 目的要求 • 1、了解从细胞中提取DNA的基本 原理 • 2、初步掌握DNA的粗提取和鉴定 的方法 • 3、观察提取出来的DNA实验思路 • 1、DNA从哪提取？ • 2、怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？ • 3、怎样鉴定我们提取的DNA？实验原理 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着 NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物 质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解 度最低。利用这一原理，可以使溶解在 NaCl溶液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些 物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理， 可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因 此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。实验材料和用具 实验材料： 1、鸡血细胞液（5~10ml）； 2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于 冰箱内冷却24h）； 3、蒸馏水； 4、质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸钠溶液； （抗凝剂） 5、物质的量浓度分别为2mol/L和0．015mol/L 的NaCl溶液； 6、二苯胺试剂。实验用具：铁架台；铁环；镊子；三 角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻 璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一 个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、 500ml各二个）；试管（20ml，二个）； 漏斗；试管夹；纱布。 8、DNA的鉴定 ① DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因 此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 ②紫外灯照射法 A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴 化已锭（EB） B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上， 再滴一滴EB溶液染色 C、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射（暗室 中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰 在260 nm处) ③甲基绿 （蓝绿色）二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计 （一）实验材料的选取 材料：新鲜的鸡血 注意： 本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸 钠溶液） 原则上只要含DNA的生物材料都可以，但 是选取DNA含量相对较高的生物组织，成 功率更大。(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞 (2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用 玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、破碎细胞 讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 利用了什么原理？ 2、过滤，获取含DNA的滤液讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去 除杂质 答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高 盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出， 能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反 复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度 不同的多种杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而 使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是 DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋 白质变性，与DNA分离 方案二利用了酶的专一性；方案三利用了 DNA的稳定性。（四） DNA的析出与鉴定 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒 精溶液（体积分数为95％），静置2-3min，溶 液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用 滤纸吸取上面的水 1、DNA的析出2、 DNA的鉴定 鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为 2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一 只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。 混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试 管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看 看溶解有DNA的溶液是否有蓝色小结 • 1、DNA的粗提取与鉴定的方法 • 2、原理 • 3、实验设计的步骤，原则 作业 尝试用植物细胞（如新鲜的菠菜）来做这 个实验。（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的 粗提取 三、实验案例 ②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞 作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求 较高，操作繁琐，历时较长 1、鸡血细胞做实验材料的原因 ①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得2、实验原理 ① DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的 浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为 0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原 理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 ② DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋 白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进 一步提取出含杂质较少的DNA。 ③ DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此， 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。4、课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝 剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的 鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血 液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧 杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞 自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用 1000r/min（转每分）的离心机离心2min， 血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除 去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞 液。） ①过程②柠檬酸钠作用 防止血液凝固 ③作用机理 柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠 檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少， 血液就不会凝固 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃 容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的 损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞 液 ④注意事项答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以 溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可 以析出,悬浮于溶液中 讨论： （2）观察丝状物呈什么颜色？ 答：白色 （1）为什么要加50mL的冷酒精？讨论： 答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是 原来颜色 （2）这一鉴定结果说明什么问题？ （1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？ 答：提取出的丝状物是DNA （3） DNA的直径约为20×10-10 m，实验中 出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径 的大小？ 答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多 个DNA子聚在一起形成的 答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两 次析出，六次搅拌” 6、讨论： ①两次蒸馏水 第一次：细胞吸水胀破 第一步 第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步 （1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过 滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有 关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要 使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液， 使用的纱布为1－2层 ②三次过滤 第一次： DNA存在于滤液里 第一步 第二次： DNA被留在纱布上 第四步 第三次： DNA存在于滤液里 第六步③两次析出 第一次：用0.14 mol／L 的NaCI 溶液含杂质多 第三步 第二次：用冷却的95％的酒精 第七步 ④六次搅拌：第一、二、三、五、七步 其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌， 在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直 插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去 除杂质？ 答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高 盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出， 能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过 反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解 度不同的多种杂质（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的 粗提取 1、课前准备 将新鲜菜花和体积分数为95％的乙醇溶液放 入冰箱冷冻室24 h 2、提取DNA的具体步骤 ①取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎 ②研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨 液，充分研磨10 min研磨液的配制方法如下：将10.1 g Tris加入到 50 mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述 药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1 000 mL Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中 呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷） EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑 制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性， 与DNA分离③过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨 液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑 料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速， 离心2～5 min，取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液 ④沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的 体积分数为95％的预冷乙醇溶液中，并用玻 璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插 到烧杯底部)。沉淀3～5 min后，可见白色的 DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮 状物缠绕在玻璃棒上观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物， 说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色 说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所 提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误， 需要重新制备 四、课题成果评价 （一）是否提取出了DNA本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核 蛋白、多糖等杂质 （二）分析DNA中的杂质 （三）不同实验方法的比较 对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方 法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同 种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验 结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显 色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法 的效果更好专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA 片断★★分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★★其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内DNADNA分子复制的过程分子复制的过程 美美 国国 科科 学学 家家 　　 穆穆 利利 斯斯( ( K K . . B B . . M M u u l l l l i i s s ) ) 发发 明明 了了P P C C R R 技技 术术 　　1 1 9 9 9 9 3 3 年年 诺诺 贝贝 尔尔 奖奖 ㈠.DNA分子的结构 C、H、O、N、P1.元素组成： 脱氧核苷酸2.基本单位: 一.基础知识 脱氧核 苷酸 脱氧核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮 碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T）一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的““－－OH”OH”和和另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第33位碳原子位碳原子 上的羟基上的羟基之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，即在即在相邻的相邻的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸 的的3’3’和和5’5’碳原子碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过 3’3’、、5’5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将DNADNA的的羟基羟基 ““－－OH”OH”末端称为末端称为3’3’端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5’5’端端 3.多脱氧核苷酸链得形成 多脱氧核苷酸链结构简图4.DNA分子的双螺旋结构 ⑴.DNA分子是由 的（即一条 链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧 核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。 ⑵. 与 交替连结，排列在外侧， 构成基本骨架； 排列在链的内侧。 ⑶.两条链上的碱基通过 连结起来，形 成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即 腺嘌呤一定与 配对， 一定 同胞嘧啶配对。 双螺旋 两条反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 氢键 胸腺嘧啶 鸟嘌呤㈡.DNA的复制 2.时期 有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。 3.场所 细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。 1.概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。 4.基本条件 酶:解旋酶、DNA聚合酶 能量:ATP 原料:四种脱氧核苷酸 模板:DNA的两条链⑴.边解旋边复制(过程） 5.复制特点 ⑵.半保留复制（结果） 6.遵循原则：碱基互补配对原则 7.精确复制的原因 8.复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后 代，从而保持了遗传信息的连续性 ⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分参与的组分 在在DNADNA复制中的作用复制中的作用 解旋酶解旋酶 DNADNA母链母链 44种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶 引物引物 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开打开DNADNA双链双链 提供提供DNADNA复制的模板复制的模板 合成子链的原料合成子链的原料 催化合成催化合成DNADNA子链子链 使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3’3’ 端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸㈢.PCR(多聚酶链式反应） 2.DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延 伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 3.DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延 伸。 1.定义： 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极 少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万 份的DNA拷贝。4.PCR原理 ⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结 构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 ⑵.当温度缓慢降低后， 两条彼此分离的DNA链 又会重新结合成双链。 ⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度 来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实 质上也是一台能够自动调控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶聚合酶 失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致 DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。 5.Taq DNA聚合酶的应用 6.需要为PCR反应提供的物质 缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合 的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚 合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反 复进行。 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸 扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等突出。 7.PCR技术的特点：8.细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 体内DNA的复制 PCR 模板模板((母链母链 )) 引物引物 原料原料:dNTP:dNTP 聚合酶聚合酶 反应环境反应环境 细胞内源细胞内源 引物合成酶引物合成酶 细胞内的环境细胞内的环境 细胞内源细胞内源 细胞内源细胞内源 外源加入外源加入 缓冲液缓冲液 外源加入外源加入 外源加入外源加入 外源加入外源加入⑴.PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合 成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核 苷酸 9.细胞内复制和PCR不同点 ⑵.PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通 过对反应温度的控制来实现的 10.PCR的重要应用： 广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物 学、基因克隆和DNA序列测定等。1、PCR仪 ㈠.设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器。 二.PCR的实验操作2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液 体，其上的一次性吸液枪头 用一次更换一次。1.准备 2.移液 ㈡.实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的 试剂摆放在实验桌上。 用微量移液器按照PCR反应体系配方 往微量离心管里面加入各种试剂。 混合后盖严微量离心管口的盖子， 用手指轻轻弹击管壁。 3.混合 ⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心 约10s。 4.离心 ⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部， 提高反应效果。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循 环程序。 5.反应 循环数循环数 变性变性 复性复性 延伸延伸 第一次第一次 94℃94℃，，10min10min －－ －－ 3030次次 94℃94℃，，30s30s 55℃55℃，，30s30s 72℃72℃，，1min1min 最后一次最后一次 94℃94℃，，1min1min 55℃55℃，，30s30s 72℃72℃，，1min1min PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分 为三个基本步骤──变性、复性和延伸.⑴.变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离， 使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反 应作准备。 ⑵.复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到 500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合。 ⑶.延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作 用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按 碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合 成一条新的DNA链。靶序列靶序列 靶序列靶序列 PCR 循环第一步：高温变性靶序列靶序列 靶序列靶序列 引物引物 ⅠⅠ 引物引物 ⅡⅡ 5’5’ 3’3’ 5’5’ 5’5’ 3’3’ 5’5’ 3’3’ 3’3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火靶序列靶序列 靶序列靶序列 引物引物Ⅰ 引物引物Ⅱ 5’5’ 33 ’’ 5’5’ 5’5’ 3’3’ 5’5’ 3’3’ 3’3’ Taq DNATaq DNA 聚合酶聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸靶序列靶序列 靶序列靶序列 第1个PCR循环完成后 ：得到两个靶序列PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的 污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： 6.注意事项 ⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲 液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头㈠.理论上DNA扩增数目的计算 三.课题成果评价 1.一条DNA，复制n次，DNA为2n 2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n ㈡.实验中DNA含量的测定 1.原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果， DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸 收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。 2.过程 ⑴.稀释 2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即 将样品进行50倍稀释.⑵.对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将 紫外分光光度计的读数调节至零。 取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处 的光吸收值 ⑶.计算 ⑷.计算 DNA含量(g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数 50：1 g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸 光值为0.02光 吸 收 波长／nm260240220 280 0.1 0.2比色杯四.课题延伸 例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩 增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快 速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点