专练15生物技术实践冲刺高考20题一、微生物培养1．（2020·辽宁省高三其他）大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一类细菌，含有2000种以上的蛋白质；大肠杆菌的数量是检测自来水是否受粪便污染的最直接的指标。回答下列问题：（1）利用凝胶色谱法分离提取到的部分大肠杆菌蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，加入pH为7.0、浓度为20mmol/L的___________到适当高度进行洗脱，结果甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，则相对分子质量较大的是_____蛋白质。（2）通过滤膜法可以测定自来水中大肠杆菌的数目：一定体积的自来水样过滤后，将滤膜放在伊红-美蓝培养基（主要成分包括：蛋白胨、NaCl、琼脂、乳糖、伊红和美蓝水溶液）上培养，大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝反应，使菌落呈黑色。根据培养基上菌落的数目，计算出大肠杆菌的数量。①伊红-美蓝培养基属于____（填“选择”或“鉴别”）培养基，蛋白胨的作用有_________。②在微生物培养过程中，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和高压蒸汽灭菌。配制伊红-美蓝培养基时，乳糖需要单独在压力为70kPa，温度为115℃灭菌20min，原因是__________。接种前通常需要检测固体培养基是否灭菌合格，检测方法是___________。③滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是_______________。【答案】磷酸缓冲液甲鉴别提供碳源、氮源、维生素干热灭菌乳糖在高温下会破坏将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落出现（当样品中细菌浓度低时，）培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌【解析】【分析】阅读题干信息可知，本题所以大肠杆菌为实验材料，考查蛋白质的提取与鉴定实验、测定自来水中大肠杆菌的数目实验，回忆和梳理相关知识点，据此答题。【详解】（1）利用凝胶色谱法分离蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，需要加入pH为7.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度进行洗脱，若甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，说明甲蛋白质的相对分子质量较大。（2）①伊红-美蓝可以将大肠杆菌染成深紫色，因此伊红-美蓝培养基属于鉴别培养基，其中蛋白胨可以为大肠杆菌提供碳源、氮源、维生素。
②微生物培养过程中，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。由于乳糖在高温下会破坏，所以在配制伊红-美蓝培养基时，乳糖需要单独在压力为70kPa，温度为115℃灭菌20min。接种前通常需要将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落出现，以检测固体培养基是否灭菌合格。③滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌。【点睛】解答本题的关键是掌握蛋白质的提取与鉴定实验、测定自来水中大肠杆菌的数目实验的相关知识点，弄清楚蛋白质提取和鉴定的原理，并能够合理分析大肠杆菌培养过程中灭菌的方法和计数的原理。2．（2020·江苏省江浦高级中学高三二模）土壤中含有能将难溶性磷酸盐转变成植物可以吸收利用的可溶性磷的优良解磷菌株Q。下图1表示制备固体培养基过程中的某操作，图2是科研人员从土壤中分离出菌株Q的部分过程示意图。请回答下列问题：（1）图1所示操作称为__________________，待平板冷凝后__________，以防止__________________。（2）图2所示接种方法是_______________________。在3个平板上分别接人0．1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1g土壤中的活菌数约为__________________个。（3）图是某同学利用不同于图2方法分离菌株Q的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的有_______。a．操作前用无水乙醇对双手进行消毒处理b．划线时沾有菌种的接种环不能插入培养基中
c．只有在⑤区域中才能得到所需菌落d．整个过程需要对接种环进行6次灼烧（4）固体培养基中难溶性磷酸盐在菌株Q的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈（如下图所示），透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解难溶磷酸盐的能力大小。下表是初步筛选出的三种优良解磷菌株。菌株透明圈直径(D)菌落直径(d)M—3—0118．812．3B3—5—620．78．0T—4—019．16．5根据实验结果分析，溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是______________。该菌种分离纯化后，常用______________________法进行长期保存。【答案】倒平板倒置皿盖上的冷凝水落入培养基稀释涂布平板法4×108a、cB3－5－6甘油管藏【解析】【分析】1、微生物常用的接种方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。2、计算样品菌液中的菌株数时，每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表样品菌液的稀释倍数。【详解】
（1）图1所示操作称为倒平板，待平板冷凝后需要将其倒置，以防止皿盖上的冷凝水落入培养基，对培养基造成污染。（2）图2所示接种方法是稀释涂布平板法，1g土壤共稀释了106倍。平板上生长的平均菌落数=(38+42+40)÷3=40个，每克样品中的菌株数=(C÷V)×M=(40÷0.1)×106=4×108个。（3）a、操作前用70%的酒精对接种人员的双手进行消毒处理，a错误；b、划线时沾有菌种的接种环不应划破培养基表面，b正确；c、在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落，c错误；d、在每次划线前和最后一次划线结束均需对接种环灭菌，因此需要对接种环进行6次灼烧，d正确。故选ac。（4）根据实验原理中“透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解难溶磷酸盐的能力大小”，结合表格数据可以确定溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是B3-5-6。对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏法。【点睛】本题结合图示和表格，考查微生物的培养和分离，要求考生识记接种微生物常用的两种方法及无菌技术；能根据实验原理及实验结果答题，属于考纲识记和理解层次的考查。3.（2020·广东省高三一模）人类利用传统发酵技术使各种微生物经过发酵作用制作各种食品，在这些操作过程中请你通过相关微生物的形态、结构以及生长繁殖的环境条件等特点回答以下问题：（1）果酒的制作是利用酵母菌在______________的温度条件且______________条件下产生酒精；利用醋酸菌制作果醋的过程中则有两条途径得以实现：一个是____________________________，另一个是____________________________。（2）为了更好地研究这些微生物的生命特征，研究人员往往要先配制适宜的培养基，通常用______________对菌种进行扩繁，用______________来观察菌落特征以辨别菌种。（3）将分别盛有9毫升水的6支试管灭菌，并按101-105编号，按下图中操作对乳酸菌进行系列稀释，则6号试管中菌液浓度为4号的______________，若在5号试管中取样，在平板中涂布出的菌落平均数为218，则原液中菌落浓度为______________个/毫升。
（4）在统计菌落数目的过程中甲乙两组同学分别用______________测定同一样品中的菌落数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到了不同的结果，甲组同学在第一个48小时内涂了一个平板，统计菌落数为215，为了增强可信度该同学又在第二个48小时内的了第二个平板，统计菌落数为232，在第三个48小时内涂了第三个平板，统计菌落数为288；乙组同学则只用了一个48小时，同时涂了3个平板，统计面落数分别为21、212和256，两组同学都以这三个统计结果的平均数作为实验最终数据：甲组为247，乙组为163。你认为_____的结果更接近真实值，你认为这两组的实验需要改进吗?_____；改进方法是_______________________。【答案】18-25℃缺氧和酸性在氧气和糖源都充足时葡萄汁中的糖分解为醋酸当缺少糖源时将乙醇变为乙醛，进而形成醋酸液体培养基固体培养基1%218╳105稀释涂布平板法甲组需要甲组应该同时涂三个平板，乙组应该舍掉21那一组，重新取样再做一组【解析】【分析】1、在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵；酒精发酵的最佳温度是在18℃～25℃，pH最好是弱酸性。2、醋酸菌好氧性细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；醋酸菌生长的最佳温度是在30℃～35℃。3、稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。【详解】（1）酵母菌产酒的最适温度为18-25℃,且缺氧呈酸性的条件下产生酒精；而醋酸杆菌产生果醋时在有糖和无糖的时候都可以完成，所以有两条途径，一个为在氧气和糖源都充足时葡萄汁中的糖分解为醋酸，另一个为当缺少糖源时将乙醇变为乙醛，进而形成醋酸。（2）液体培养基可以使微生物和菌液充分接触，提高微生物的生长速率，所以可以用液体培养基对菌种扩繁；而菌落的形成是在固体培养基上，所以用固体培养基观察菌落特征。（3）系列稀释的操作是涂布计数之前的重要步骤，同时也涉及这之后对菌液浓度的估算，如本题图所示，菌液每稀释一次，浓度就减少到原来的1/10，所以6号是4号浓度的1/100，5号则是原液稀释5次之后的浓度，所以原液浓度应为218╳105个/mL
（4）测定活菌的数目通常使用稀释涂布平板法；微生物计数时应该选取30-300菌落数的平板，甲组统计了3次并求平均值，更接近真实值；微生物菌种是活菌，随着时间变化细菌浓度会改变，所以操作不应该分时间前后，因此甲组也不合理，应该同时涂三个平板，而乙组计数时有21菌落数出现，应该舍掉21那一组，为了增加信度应重新取样再做一组。【点睛】本题考查果酒、果醋的制作，考生识记其基本原理，同时结合稀释涂布平板法的基本操作步骤分析（3）和（4）。4．（2020·四川省高三三模）大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌。少数种类的大肠杆菌在一定条件下会使人患病，如肠道出血性大肠杆菌可使人腹泻和便血，严重时危及生命。出血性大肠杆菌在添加血液的平板培养基上生长时，红细胞被细菌破坏而褪色，导致菌落周围形成透明圈。下图表示从污染的食物中分离和提纯该细菌的操作流程。请回答问题：（1）细菌从肉汤培养基获得的营养成分有______________。（2）据操作流程可知，将细菌接种在血平板上的方法是______________，接种完毕后要灼烧接种工具的目的是为了______________。（3）研究细菌的致病性，先要获得纯度较高的细菌蛋白，凝胶色谱法是分离蛋白质的常用方法，在装填凝胶柱时不得有气泡产生，因为______________；若肠道出血性大肠杆菌的A蛋白质比B蛋白质后洗脱出来，则______________的相对分子质量较大。（4）纯化后的细菌蛋白可以用_________测定分子量大小，在此过程中加入的SDS掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使得______________完全取决于分子的大小。【答案】碳源、氮源、水、无机盐等平板划线法避免污染环境和感染操作者气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B蛋白电泳法电泳迁移率【解析】【分析】1、培养微生物的各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、无机盐、碳源、氮源。
2、微生物培养时的接种方法最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌或真菌繁殖而成的子细胞群体——菌落。3、凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分析蛋白质的有效方法，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。【详解】（1）肉汤培养基中含有水分、无机盐、蛋白质等物质，因此可为微生物提供的营养成分有：碳源、氮源、水和无机盐。（2）据操作流程可知，图中的接种工具是接种环，故将细菌接种在血平板上的方法是平板划线法；接种完毕后要灼烧接种工具的目的是避免污染环境和感染操作者。（3）研究细菌的致病性，先要获得纯度较高的细菌蛋白，凝胶色谱法是分离蛋白质的常用方法，由于气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，故在装填凝胶柱时不得有气泡产生；凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此若肠道出血性大肠杆菌的A蛋白质比B蛋白质后洗脱出来，则B蛋白的相对分子质量较大。（4）纯化后的细菌蛋白可以用凝胶电泳法测定分子量大小；用凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，需要在凝胶中加入SDS，目的是消除净电荷对迁移率的影响（或掩盖不同种蛋白间的电荷差别），使电泳迁移率完全取决于分子的大小。【点睛】本题综合考查培养基的营养成分、微生物的接种方法、蛋白质的分离计数等相关知识，要求考生能够识记凝胶色谱法分离蛋白质的过程，识记其中的关键步骤。5．（2020·安徽省高三三模）酵母菌易于培养且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。根据所学知识，回答下列问题：（1）酿制果酒时一般将温度控制在___________，此时在酵母菌细胞的________中进行无氧呼吸，其产物乙醇与_______________溶液反应呈现灰绿色。（2）某同学采用马铃薯琼脂培养基对酵母菌进行纯化培养，接种酵母菌的方法多种，每种技术操作方法各不相同，但其核心都是___________________________。（3）该同学用稀释涂布平板法将某稀释度的菌液涂布多个平板，在适宜的条件下分别培养3天后，观察菌落的_________________（答出两点即可）等特征。若平板内菌落特征有明显的差异，可能是培养基灭菌不彻底，可以________________________________进行检测。
（4）现代果酒制造业中，酵母细胞的固定化已经越来越普遍。固定化细胞多采用____________法，该方法对酵母细胞进行固定化过程中，溶化海藻酸钠时采用小火间断加热的方法，目的是______________________________________________________。【答案】18～25℃细胞质基质酸性重铬酸钾要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度形状、大小、隆起程度、颜色将同批次未接种的培养基置于相同条件下培养包埋防止加热太快，海藻酸钠发生焦糊【解析】【分析】1、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。果酒制作的原理：（1）在有氧条件下，反应式如下：C6H12O6+6H2O+6O26CO2+12H2O+能量；（2）在无氧条件下，反应式如下：C6H12O62CO2+2C2H5OH+能量。2、果酒和果醋制作过程中的相关实验操作：（1）材料的选择与处理：选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，除去枝梗。（2）灭菌：①榨汁机要清洗干净，并晾干。②发酵装置要清洗干净，并用70%的酒精消毒。（3）榨汁：将冲洗除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。（4）发酵：①将葡萄汁装人发酵瓶，要留大约1/3的空间，并封闭充气口。②制葡萄酒的过程中，将温度严格控制在18℃~25℃，时间控制在10~12d左右，可通过出料口对发酵的情况进行，及时的监测。③制葡萄醋的过程中，将温度严格控制在30℃~35℃，时间控制在前7~8d左右，并注意适时通过充气口充气。【详解】（1）20℃左右最适合酵母菌繁殖，因此酒精发酵时一般将温度控制在18~25℃，此时在酵母菌细胞的细胞质基质中进行无氧呼吸，其产物乙醇与酸性重铬酸钾溶液反应呈现灰绿色。（2）接种酵母菌的方法多种，但都要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。（3）该同学用稀释涂布平板法将某稀释度的菌液涂布多个平板，在适宜的条件下分别培养3天后，观察菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等特征。若平板内菌落特征有明显的差异，可能是培养基灭菌不彻底，可以将同批次未接种的培养基置于相同条件下培养进行检测。（4）与酶相比，酵母菌细胞体积较大，多采用包埋法进行固定，该方法对酵母细胞进行固定化过程中，为防止加热太快，海藻酸钠发生焦糊，溶化海藻酸钠时采用小火间断加热。【点睛】
本题综合考查果酒和果醋制作的相关知识，意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系，形成知识网络结构的能力；能运用所学知识，准确判断问题的能力，属于考纲识记和理解层次的考查。6．（2020·安徽省高三二模）垃圾分类、文明环保。某研究团队拟从餐厨垃圾中分离具有高效降解淀粉能力的微生物，并制成菌制剂用于餐厨垃圾高效无害化处理。对所取餐时垃圾浸泡液进行产淀粉酶细菌的分离操作（A组）和计数操作（B组），过程如图。请回答下列回题：（1）步骤④，⑤所用培养基的成分，最大的区别是固体培养基中添加了______________，步骤③、④所用培养基的成分，最大的区别是______________种类不同，步骤⑤、⑧接种时需设置未接种培养基做对照，目的是______________________________________________________________________。（2）步骤⑧的接种方法是____________________________。取1mL菌液稀释1000倍，分别将0．1mL的菌液涂布在4个平板上。经培养后4个平板的菌落数分别是58、60、56和28，则发酵液中酿酒酵母的数量为______________个/mL。该统计结果往往低于实际活菌值，原因是______________________。（3）从细菌体内提取出来的淀粉酶首先要检测______________，以便更好地将酶用于生产，还可采用固定化酶技术中的______________方法使酶能反复利用。【答案】琼脂碳源检测培养基是否被污染稀释涂布平板法5．8×105当两个或多个菌连在一起时平板上观察到的是一个菌落酶的活性（活力）物理吸附或化学结合【解析】【分析】检测土壤中细菌总数，题图所示采用的计数方法是稀释涂布平板法进行计数；用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数时，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30～300的进行记数，求其平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数。
【详解】（1）步骤④中为液体培养基，步骤⑤为接种在固体培养基培养，两者最大的区别是固体培养基中添加了琼脂；步骤③为扩大培养，而步骤④为选择培养基，选择培养使用的培养基为选择培养基，因此所用的培养基的成分，最大的区别是碳源种类不同，即选择培养基中需要以淀粉作为唯一碳源；为检测培养基是否被污染，步骤⑤、⑧接种时需设置未接种培养基做对照，通过比较空白培养基与接种培养基的菌落数目检测污染情况。（2）图中步骤⑧接种后需要计数，故接种方法为稀释涂布平板法；应选择均数在30〜300之间的菌落进行计数，故发酵液中酿酒酵母的数量为（58＋60＋56）/3÷0.1×1000=5．8×105个/mL；因为当两个或多个菌连在一起时，平板上观察到的是一个菌落，故用稀释涂布平板法统计结果往往低于实际活菌值。（3）从细菌体内提取出来的淀粉酶首先要检测酶的活性（活力），以便更好地将酶用于生产；固定化酶的方法主要有化学结合法和物理吸附法。【点睛】本题考查微生物的分离和培养的有关知识，要求考生识记无菌技术的主要内容，识记接种微生物常用的两种方法，能结合所学的知识准确答题。7．（2020·高三其他）大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一类细菌，含有2000种以上的蛋白质；大肠杆菌的数量是检测自来水是否受粪便污染的最直接的指标。回答下列问题：(1)利用凝胶色谱法分离提取到的部分大肠杆菌蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，加入pH为7.0、浓度为20mmOl/L的________到适当高度进行洗脱，结果甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，则相对分子质量较大的是______________蛋白质。(2)通过滤膜法可以测定自来水中大肠杆菌的数目：一定体积的自来水样过滤后，将滤膜放在伊红-美蓝培养基（主要成分包括：蛋白胨、NaCl、琼脂、乳糖、伊红和美蓝水溶液）上培养，大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝反应，使菌落呈黑色。根据培养基上菌落的数目，计算出大肠杆菌的数量。①伊红-美蓝培养基属于_____(填“选择”或“鉴别”)培养基，蛋白胨的作用有_____(答出两点即可）。②培养大肠杆菌时，在接种前通常需要检测固体培养基是否被污染，检测方法是______。③用滤膜法进行测定时，滤膜的孔径应_______(填“大于”或“小于”）大肠杆菌。滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是___。【答案】磷酸缓冲液甲鉴别提供碳源、氮源、维生素将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间,观察培养基上是否有菌落出现小于
(当样品中细菌浓度低时,)培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的个活菌【解析】【分析】1、凝胶色谱法的原理是:小分子蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长、移动速度较慢,后被洗脱出来:而分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,路程较长、移动速度较快,先被洗脱出来。2、大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝发生特定的颜色反应,使菌落呈黑色,故可用含有伊红-美蓝的鉴别培养基鉴别大肠杆菌。3、滤膜法测定活菌数目的原理：当样品中细菌浓度低时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌。【详解】(1)凝胶色谱法的原理是:小分子蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长、移动速度较慢,后被洗脱出来:而分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,路程较长、移动速度较快,先被洗脱出来，则相对分子质量较大的是甲，所用洗脱液是磷酸缓冲液。(2)①大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝发生特定的颜色反应,使菌落呈黑色,该培养基是伊红-美蓝培养基,因此属于鉴别培养基,蛋白陈是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成,富含有机氮化合物,也含有一些维生素和糖类,因此添加在培养基中主要作为氮源,也可提供碳源和维生素；②检测培养基是否被污染,需在接种前将空白培养基即未接种的培养基放在适宜的条件下放置一段时间,观察培养基上是否有菌落出现,若有菌落出现,则说明培养基被污染或灭菌不彻底,不能用于接种实践。③滤膜法测定活菌数目的原理是,当样品中细菌浓度低时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌，滤膜的孔径应小于大肠杆菌。【点睛】分析解答本题关键需要明确三个原理：一是凝胶色谱法的原理；二是解答大肠杆菌的原理；三是滤膜法测定活菌数目的原理。8．（2020·陕西省高三二模）有些细菌可分解原油，从而消除原油泄漏造成的环境污染，某同学欲从土壤中筛选出高效降解原油的菌株，回答下列问题：（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以___________为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于__________培养基。
（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有_________________和_________________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯____________附近进行，以避免环境中微生物的污染。（3）对这些微生物的临时保藏，通常首先将菌种接种到试管的固体___________培养基上，在合适的温度下培养，菌落长成后，将试管放入_________℃的冰箱中保藏。（4）醋酸杆菌是生产葡萄醋必用的菌种，可以从食醋中分离得到纯化的醋酸杆菌。扩大培养醋酸杆菌时，一般采用平板倒置培养，原因是____________________________________。【答案】原油选择稀释涂布平板法平板划线法火焰斜面4防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基造成污染【解析】【分析】1、从土壤中分离微生物的一般步骤是：土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。筛选目的菌的培养基应该是选择培养基，培养基制作完成后进行灭菌处理，所有操作应该确保无菌操作。2、常用的固体培养基上的接种方法是稀释涂布平板法和平板划线法。3、培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。【详解】（1）在筛选高效降解原油的菌株过程中，应将土壤样品稀释液接种于以原油为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于选择培养基。（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法；为防止杂菌污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（3）临时保藏，通常首先将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养，菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。（4）扩大培养醋酸杆菌时，一般采用平板倒置培养，原因是防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基造成污染。【点睛】本题考查了微生物的分离与培养以及培养基对微生物的选择作用，要求考生能够掌握微生物培养过程中的无菌技术的主要内容，识记微生物分离与纯化常用接种方法，根据培养的要求确定选择培养基的成分。9．（2020·高三开学考试）[生物--选修1：生物技术实践]某实验小组欲从豆油污染的土壤中筛选出能高效降解脂肪的菌株。请回答：
（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_____________为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于___________培养基。（2）为避免培养皿污染，需将培养皿呈____________状态放置。为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行__________处理。为了排除培养基被污染，需设置接种______________的培养基作为空白对照。（3）为了筛选出菌株，可将适量的_________试剂滴加在平板中的菌落周围，洗去浮色后，如果菌落周围出现透明圈，则说明此种菌能够分泌脂肪酶。纯化菌种时，为了对活菌进行计数，可采用___________法接种于新的培养基平板上。【答案】豆油（脂肪）选择倒置梯度稀释（或系列稀释）等量无菌水苏丹III（苏丹IV）稀释涂布平板【解析】试题分析：微生物的培养基按用途分，可以分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基主要是培养、分离特定的微生物，培养酵母菌可在培养基中加入青霉素；鉴别培养基可以鉴定不同的微生物，比如鉴别饮用水中是否含有大肠杆菌，可以用伊红-美蓝培养基，如果菌落呈深紫色，并带有金属光泽，说明有大肠杆菌。微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。（1）欲筛选出能降解豆油的菌株，培养基中应只含有豆油而无其它碳源，不能降解豆油的细菌在此培养基上不能生存，从功能上讲，这类培养基属于选择培养基。（2）为避免培养皿污染，需将培养皿呈倒置状态放置．为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行梯度稀释处理．为了排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，需设置接种等量无菌水的培养基作为空白对照。（3）脂肪可用苏丹Ⅲ染液（或苏丹Ⅳ染液）鉴定，呈橘黄色（或红色），由于脂肪遇苏丹Ⅲ染液（或苏丹Ⅳ染液）会出现红色，所以为了筛选出菌株，可将适量的试剂滴加在平板中的菌落周围，洗去浮色后，如果菌落周围的现象是出现透明圈、不出现红色圈，则说明此种菌能够分泌脂肪酶。纯化菌种时，为了对活菌进行计数，可采用稀释涂布平板法接种于新的培养基平板上。10．（2020·福建省高三二模）为了获得耐热耐辐射微生物资源，某生物兴趣小组在新疆库木塔格沙漠某区域取样，利用常规平板分离方法进行分离培养，定向筛选出耐高温耐辐射菌株，实验流程如下，分析并回答下列问题：
（1）生物兴趣小组选择在该区域取样的原因是____________________________________。（2）配制LB肉汤培养基需添加一定量的NaCl，其目的是________________________，对LB肉汤培养基一般采用_____灭菌；驯化培养过程中，对活菌纯化并计数的方法是___________，测得的活菌数往往比实际值_________，原因是________________________________________。（3）某同学为探究已纯化的菌株能否分解纤维素，他将此菌株接种在纤维素分解菌选择培养基上，一段时间后，培养基上出现了菌落，该同学认为此菌株能分解纤维素，但其他的同学并不认同他的观点，你认为他们的理由是____________________________________________________。【答案】该区域温度较高、遭受辐射较强为微生物提供无机盐（为微生物提供无机盐，调节渗透压）高压蒸汽灭菌稀释涂布平板法低两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落实验缺少空白对照；操作不规范【解析】【分析】根据题意中目的菌株的采集、分离、纯化培养的步骤分析：菌株采样需要根据所需菌株的特征进行针对性选择采样区域。培养基的配制需要适宜的选择培养基，且营养成分要齐全，必须包括有碳源、氮源、水和无机盐等，配制好后还需要用高压蒸汽灭菌。而分离纯化的接种培养方法常见有：平板划线法和稀释涂布平板法。如果还要进行活菌计数，则只能选择稀释涂布平板法。【详解】（1）根据筛选目的菌株的特点，生物兴趣小组之所以选择在该区域取样是因为该区域温度较高、遭受辐射较强。（2）培养基中添加一定量的NaCl，其作用是为微生物提供无机盐，调节渗透压；对培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌；驯化培养过程中，对活菌纯化并计数的方法是稀释涂布平板法，这种方法测得的活菌数往往比实际值低，是因为涂布培养时常常存在两个或多个细胞连在一起，而平板上只能观察到一个菌落。（3）为探究已纯化的菌株能否分解纤维素，将此菌株接种在纤维素分解菌选择培养基上，一段时间后，培养基上出现了菌落。结合实验设计要遵循对照实验的原则分析，该同学的实验设计中缺乏空白对照组，即不接种该筛选菌株，培养基中是否会出现菌落产生。【点睛】注意本题（3）小题中实验评价分析，关键在于设计实验需要遵循的对照性原则不能忽视。
二、传统发酵食品工艺11.（2020·新疆维吾尔自治区高三三模）泡菜制作方便、口味独特，深受人们喜爱。泡菜的腌制方式、时间、温度等条件对泡菜品质有很大的影响，泡菜制作过程中的微生物数量和亚硝酸盐含量变化也受到人们的关注，利用生物学知识对泡菜腌制过程进行科学管理意义重大。请回答下列问题：（1）泡菜腌制过程中，进行发酵的主要微生物在细胞结构上属于______生物。不能采用加入抗生素的方法来抑制杂菌的原因是____________________________。（2）在泡菜腌制的过程中，要注意相关条件的控制。首先，要选择合格的泡菜坛，并用水封的方式密闭处理，以保证坛内发酵所需的_________环境。另外，温度过高、________用量过少、腌制时间过短，容易造成乳酸菌大量繁殖，亚硝酸盐含量______。泡菜坛内常常会出现一层白膜，这是由产膜酵母的繁殖形成的，酵母菌的呼吸类型为________________。（3）在检测亚硝酸盐含量时，可将显色反应后的样品与已知浓度的_______进行目测比较，从而大致估算泡菜中亚硝酸盐的含量。（4）我们在日常生活中应多吃新鲜蔬菜，不宜多吃腌制蔬菜的原因是______________。【答案】原核抗生素会抑制乳酸菌的生长和繁殖无氧食盐增加兼性厌氧型标准显色液腌制蔬菜含有亚硝酸盐，在体内会转化成亚硝胺，具有致癌作用【解析】【分析】制作泡菜所使用的微生物是乳酸菌，代谢类型是异养厌氧型。泡菜中亚硝酸盐的检测可以用比色法，即在盐酸酸化的条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行比较，可以估测出泡菜中亚硝酸盐的含量。【详解】（1）用于发酵泡菜的微生物是乳酸菌，在结构上属于原核生物。由于细菌对抗生素（乳酸菌属于细菌）敏感，所以在泡菜的制作过程中，不能加入抗生素，否则会抑制发酵菌种--乳酸菌的生长和繁殖。（2）乳酸菌是厌氧菌，向坛盖边沿的水槽中注满水，目的是保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。在泡菜腌制的过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量，温度过高、食盐用量过少、腌制时间过短容易造成乳酸菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。酵母菌属于兼性厌氧型微生物，既可以进行有氧呼吸，又可以进行无氧呼吸。
（3）测定亚硝酸盐含量时，在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐的含量。（4）日常生活中不宜多吃腌制蔬菜，是由于腌制蔬菜含有亚硝酸盐，在体内会转化成亚硝胺，具有致癌作用。【点睛】本题的知识点是泡菜制作的原理、方法和泡菜制作过程中的失败原因的分析，旨在考查学生对泡菜制作过程的理解和熟练识记，并应用相关知识分析、解决问题的能力。12．（2020·江苏省高三其他）镇江香醋是我国传统固态酿造食醋的典型代表，具有醇香浓厚、回味悠长的特点。由于发酵过程的半开放模式，来源于酿造原料、生产过程和操作器械的大量微生物会进入发酵液中，与酿醋功能微生物构成竞争性生长。科研人员研究酿醋主要功能微生物的发酵上清液对杂菌生长的抑制效果，并初步研究了抑菌活性物质的种类和特性，下面为部分研究结果。请分析回答：（1）镇江香醋酿制的主要功能微生物除乳酸杆菌外，还有________等，整个实验过程中所需培养皿、接种用具均需________处理。（2）科研人员先将10mL含2%琼脂的肉汤培养基倾注平板，待凝固后将无菌牛津杯(一种不锈钢管)嵌于培养基中。接着将冷却至50℃，含0．75%琼脂糖的肉汤培养基与大肠杆菌混合后倾注于牛津杯中，以制备含菌培养皿。待培养基冷却后取出牛津杯，每孔注入150μL待测样品，置于37℃下过夜培养，测定抑菌圈大小，得到如上图1所示结果。①上述制备含大肠杆菌的培养皿所采用的接种方法是________________(选填稀释涂布平板法或平板划线法)。②每孔分别注入的是灭菌的超纯水和发酵2天、4天、10天、20天后提取的发酵上清液，得到了图1中0～4的抑菌圈，说明______________________________________。（3）研究结果发现，发酵微生物上清液如果加热处理，抑菌圈会减小，由此可见，该上清液含有________(选填热敏感/耐热的或热敏感和耐热的)的抑菌活性物质。
（4）实验过程中，如使用不同的蛋白酶处理发酵微生物上清液，得到如上图2所示结果，由此可以推测，部分抑菌物质的化学本质是________，另一部分具有抑菌效果的化学物质主要是________。（5）结合上述研究结果，试分析酿醋主要微生物的生长和代谢对环境微生物的这种抑制作用的意义是______________________________________。【答案】醋酸杆菌无菌稀释涂布平板法发酵初期抑菌物质较少，随着发酵时间延长，微生物的代谢产物增多，抑菌效果逐渐增强热敏感和耐热的蛋白质有机酸（醋酸、乳酸等）维持自身功能和结构的相对稳定，保证醋酸发酵的正常进行【解析】【分析】（1）果醋制作：菌种是醋酸菌，醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸；醋酸菌的最适生长温度为30℃—35℃；（2）无菌技术：获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，主要包括以下几个方面：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（3）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）图1中形成的是大小不同的抑菌圈，抑菌圈越大，抑菌效果越好；图2使用不同的蛋白酶处理发酵上清液，会发现抑菌圈变小，说明发酵上清液中有蛋白质，而部分抑菌物质是蛋白质。【详解】（1）工业发酵在保证无菌操作的前提下，一般都是涉及多种微生物的，酿醋需要醋酸菌，所以镇江香醋酿制的主要功能微生物除乳酸杆菌外，还有醋酸杆菌等，整个实验过程中所需培养皿、接种用具均需无菌（灭菌）处理。（2）①由题干可知，上述制备含大肠杆菌的培养皿所采用的接种方法是稀释涂布平板法。②每孔分别注人的是超纯水和发酵2天、4天、10天、20天后提取的发酵上清液，得到了图1中0~4的抑菌圈，说明发酵初期抑菌物质较少，随着发酵吋间延长，微生物的代谢产物增多，抑菌效果逐渐增强。（3）研究结果发现，发酵微生物上清液如果加热处理，抑菌圈会减小，由此可见，加热并没有完全去除灭菌物质，则该上清液含有热敏感、耐热的抑菌活性物质。
（4）实验过程中，如使用不同的蛋白酶处理发酵微生物上清液，得到如图2所示结果，由此可以推测，部分抑菌物质的化学本质是蛋白质（可被高温阻断的），另部分具有抑菌效果的化学物质主要是发酵产生的有机酸。（5）结合上述研究结果，酿醋主要微生物的生长和代谢对环境微生物的这种抑制作用的意义是维持自身功能和结构的相对稳定，保证醋酸发酵的正常进行。【点睛】本题主要考查的是发酵与微生物分离和培养的相关知识。本题将发酵与微生物的分离、培养结合在一起，考查学生提取题干信息，对题干信息进行分析、表达的能力。13.（2019·河南省许昌高中高三一模）中央电视台《舌尖上的中国》栏目介绍了我国各地的美食，其中利用发酵技术制作的各类特色食品，如果醋、腐乳、泡菜等，很好的展现了广大人民群众的智慧。请回答下列问题：（1）“天地一号”苹果醋是我国著名的果醋。工业上酿制苹果醋通常有两条途径，一条途径是向捣碎的苹果汁中直接接种___________（填微生物名称）。经过一次发酵制成，在发酵过程中需要经常向发酵液中通入___________；另一条途径需经过先后两次发酵获得，即___________。（2）“王致和”腐乳是我国的著名品牌，通过发酵，豆腐中营养物质的种类___________（填“增多”或“减少”）。制作腐乳时加盐腌制后需要加入卤汤，若卤汤中的酒精含量过高，则会导致腐乳________。（3）泡菜具有独特的风味，在我国的泡菜品种中，东北酸菜和四川泡菜都非常有名，它们的制作过程基本类似，都是利用_________（微生物名称）发酵。向坛中注入盐水前，煮沸所用盐水的目的是________。在泡菜制作过程中，亚硝酸盐含量的变化情况是_________________________________。【答案】醋酸菌无菌空气先接种酵母菌获得果酒，再在果酒中接种醋酸菌进一步获得果醋增多成熟时间延长乳酸菌杀灭细菌（或灭菌）先增加后减少【解析】【分析】苹果醋的制作通常有两条途径：一条途径是向苹果汁中直接接种醋酸菌，经过一次发酵制成；另一条途径需经过先后两次发酵获得，即先接种酵母菌获得果酒，再在果酒中接种醋酸菌进一步发酵获得果醋。豆腐发酵的原理是利用毛霉等真菌产生的脂肪酶、蛋白酶对豆腐中脂肪、蛋白质进行分解，产生甘油和脂肪酸、小分子肽和氨基酸等，再经后期腌制、加卤汤、密封发酵制成。泡菜是利用乳酸菌在无氧条件下将糖类分解为乳酸制作而成。【详解】
（1）由于醋酸菌是需氧型微生物，所以它在发酵过程中需要不断向发酵液中通入无菌空气；如果糖原（苹果汁）充足，可直接接种醋酸菌进行有氧发酵产生苹果醋；如果糖原不充足，可先通过酵母菌发酵制得果酒，再向果酒中接种醋酸菌进行有氧发酵制成苹果醋。（2）根据前面的分析可知，豆腐通过霉菌分泌的酶分解，其中营养物质的种类会增多。制作腐乳时加盐腌制后需要加入卤汤，若卤汤中的酒精含量过高，会破坏霉菌产生的部分发酵酶，进而则会导致腐乳成熟时间延长。（3）泡菜都是利用乳酸菌发酵制成。向泡菜坛中注入盐水前，煮沸所用盐水的目的主要是杀灭细菌，其次又除去部分溶解氧。在泡菜制作过程中，亚硝酸盐含量的变化情况是先增加后减少。【点睛】解决本题关键要熟悉果醋、腐乳以及泡菜的制作原理。14.（2020·浙江省高三二模）回答下列（一）、（二）小题。（一）回答下列有关发酵食品生产工艺的问题：（1）豆豉是大豆经过发酵制成的一种食品。影响豆豉风味的主要因素，除了菌种类型、发酵温度、pH、氧气等环境因素，还有________（答2个因素）。（2）目前的豆豉发酵基本是一次性的，每次都经过“培养基灭菌→___→发酵→提取”，周而复始。能否________发酵、生产、提取是今后的发展方向。（3）根据所学知识判断，下面哪种微生物更适合用豆芽汁培养基培养_________A醋杆菌B酵母菌C乳酸菌D农杆菌（4）在果醋发酵工艺中，用谷壳糠等将醋杆菌固定化，装在发酵瓶，下端直角玻璃管中塞____________用以过滤空气；物料瓶内装___________________，铝箔封口。发酵过程若流速过快，则可能导致____________，为保障品质，需对发酵瓶流出液________________。（二）为开发利用沿海滩涂盐碱地，我国科学家应用基因工程培育出了耐盐碱水稻新品系，大大提高了水稻等农作物的种植面积，增加了粮食产量。据此请回答下列问题：（1）欲将耐盐碱基因和Ti质粒进行重组形成重组质粒需要的工具酶有限制性核酸内切酶和____________，限制酶一般需要________种，这样设计的目的是____________。（2）将重组Ti质粒构建完成后导入农杆菌，经筛选后，对含目的基因的农杆菌进行大量繁殖，其目的是____________。（3）取田间水稻的幼胚经消毒后接种到____________（固体、半固体、液体）培养基上诱导产生愈伤组织，利用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织后，将其接种到MS生根培养基上，在该培养基中细胞分裂素具有解除高浓度生长素____________的作用。
（4）经组培获得水稻试管苗后，提取其叶片组织中的DNA，采用PCR技术扩增目的基因，目的是为了____________。要检测到转基因水稻中目的基因的表达产物，一般采用的方法是_________。【答案】1．大豆品种（原料）、发酵时间接种连续地B脱脂棉球酒水混合物发酵不充分定期检测/监控（答到一个词给分）DNA连接酶2防止质粒和目的基因自身环化以及定向连接获取大量重组质粒（让目的基因扩增或克隆目的基因）半固体抑制根生长检测目的基因是否成功导入抗原-抗体反应【解析】【分析】1、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。果酒制作的原理：（1）在有氧条件下，反应式如下：C6H12O6+6H2O+6O26CO2+12H2O+能量；（2）在无氧条件下，反应式如下：C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量。2、参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的果糖分解成醋酸。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。3、基因工程的操作步骤：一是获取目的基因；二是构建基因表达载体（核心）；三是将目的基因导入受体细胞（导入植物细胞一般有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管道法等）；四是检测和鉴定目的基因（一是检测目的基因是否导入成功，二是检测目的基因是否成功表达，三是检测目的基因控制的性状是否在能在植株上表现出来）。【详解】（一）（1）影响豆豉风味的因素很多，包括菌种类型、发酵温度、pH、氧气等环境因素还有发酵的大豆品种原料和发酵时间。（2）发酵过程利用了微生物的代谢，因此培养过程要经过“培养基灭菌→接种→发酵→提取”。这种发酵技术基本上是一次性的，因此如何连续性低发酵、生产、提取是今后的发展方向。（3）豆芽汁培养基适合培养真菌，选项中只有酵母菌属于真菌，故选B。（4）醋酸菌是好氧细菌，下端直角玻璃管中塞脱脂棉球用以过滤空气。物料瓶内装酒水混合物，铝箔封口。发酵过程若流速过快，则可能导致发酵不充分，为保障品质，需对发酵瓶流出液进行定期检测。（二）（1）重组质粒构建过程中，用的工具酶包括限制性核酸内切酶和DNA连接酶，其中限制性核酸内切酶一般用两种，这样防止目的基因和质粒发生自身环化以及定向连接。
（2）为了获取大量重组质粒，可对含目的基因的农杆菌进行大量繁殖。（3）愈伤组织的培养采用的是半固体培养基。生长素具有两重性，低浓度促进生长，高浓度抑制生长，在MS生根培养基上，细胞分裂素具有解除高浓度生长素抑制生根的作用。（4）提取叶片组织的DNA，采用PCR技术扩增目的基因，鉴定目的基因是否成功导入。对于检测转基因水稻中目的基因是否表达，可采用抗原-抗体杂交方法。【点睛】本题考查视频发酵和基因工程的相关知识，要求考生识记相关发酵技术的原理、方法和流程，基因工程的原理及意义，掌握基因工程采用的工具及具体操作步骤，能结合所学的知识准确分析各题。三、有效成分提取15．（2020·宁夏回族自治区高三二模）研究发现柚皮精油和乳酸菌素（小分子蛋白质）均有抑菌作用，两者的提取及应用（如图所示）。（1）柚皮易焦糊，宜采用___________法提取柚皮精油，该过程得到的糊状液体可通过__________除去其中的固体杂质。（2）筛选乳酸菌A时可选用平板划线法或________接种。对新配制的培养基灭菌时所用的设备是___。实验前需对超净工作台进行___________处理。（3）培养基中的尿素可为乳酸菌A生长提供___________。根据相对分子质量的大小纯化乳酸菌素时，常用的方法是______________________。（4）抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈。可通过测定透明圈的___________来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。【答案】压榨过滤稀释涂布平板法高压灭菌锅消毒氮源凝胶色谱法大小【解析】【分析】柚皮精油如果采用蒸馏法提取时高温条件下易分解，且原料易焦糊，所以常采用压榨法提取；筛选乳酸菌时的接种方法主要有稀释涂布平板法和平板划线法，培养成功的关键是无菌操作，微生物的营养物质主要有碳源、氮源、水和无机盐等。
【详解】（1）如果利用水中蒸馏法提取芳香油，柚皮易发生焦糊现象，而且有效成分柠檬烯容易分解，因此一般采用压榨法提取；除去固体杂质的方法是采用过滤。（2）筛选乳酸菌A时可选用平板划线法或稀释涂布平板法接种，对培养基灭菌采用高压蒸汽灭菌法，所以采用的设备是高压灭菌锅；实验前需对超净工作台进行消毒处理。（3）培养基中添加的尿素虽然含有氮和碳元素，但尿素分解产生的CO2不能被异养型的乳酸菌利用，所以尿素只能为乳酸菌A生长提供氮源；纯化乳酸菌素（蛋白质）的方法常采用凝胶色谱法。（4）抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈，可通过测定透明圈的大小来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。【点睛】本题的知识点是生物有效成分的提取，发酵技术与应用，微生物培养等知识点，考生掌握几种植物有效成分的提取方法，结合微生物培养的知识进行解答。16．（2020·广西壮族自治区高三二模）水蜜桃具有美肤、清胃、润肺、祛痰等功能，其可以制作成水蜜桃汁、水蜜桃酒和水蜜桃醋等产品，深受大众喜爱。某企业对水蜜桃进行相关的制作实验，如图所示：回答下列问题：（1）打开阀2，使浑浊的水蜜桃汁与黑曲霉提取液混合后可得到较多的澄清水蜜桃汁的原因是黑曲霉提取液中含有大量的果胶酶，该酶的生理作用是________________。（2）固定化柱2中加入常用________法固定的酵母菌；与固定化果胶酶相比，固定化酵母菌所具备的特点是_________________________。（3）在外界温度和pH条件适宜的情况下，如果流入固定化柱2中的水蜜桃汁品质都非常高，但是生产的水蜜桃酒产量和质量却不够高，其可能的原因是___________________（写两点即可）。（4）固定化柱3中需加入的菌种是_______________。该菌种在__________情况下，将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，此时其所需的温度和气体条件是___________________。
【答案】分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层包埋成本更低、操作更容易、能连续生产固定化酵母菌数目较少；设备密封不严；流速控制不好；有杂菌侵入等醋酸菌糖源缺乏30~35℃，充足的氧气【解析】【分析】所谓固定化是指用物理或化学方法使酶成为不溶性衍生物或使细胞成为不易从载体上流失的形式制成生物反应器用以催化生化反应、细胞数量的增殖等。包埋法：按照包埋系数的结构可分为凝胶包埋和微胶囊法，即将细胞（物质）包裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内。【详解】（1）果胶酶能分解果胶、瓦解植物的细胞壁及胞间层，因此浑浊的水蜜桃汁与黑曲霉提取液混合后可得到较多的澄清水蜜桃汁。（2）酵母菌常用包埋法固定。与固定化果胶酶相比，固定化酵母菌所具备的特点是成本更低、操作更容易、能连续生产。（3）生产水蜜桃酒是利用酵母菌在无氧环境下进行酒精发酵，在外界温度和pH条件适宜的情况下，如果流入固定化柱2中的水蜜桃汁品质都非常高，但是生产的水蜜桃酒产量和质量却不够高，其可能的原因是固定化酵母菌数目较少；设备密封不严；流速控制不好；有杂菌侵入等。（4）固定化柱3是利用醋酸菌在有氧的条件下进行醋酸发酵，需加入的菌种是醋酸菌。该菌种在糖源缺乏情况下，将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，此时其所需的温度和气体条件是30~35℃，充足的氧气。【点睛】本题主要考查微生物的发酵，主要考查的是酒精发酵和醋酸发酵，要求学生在清楚其原理的基础上进行运用。17．（2020·安徽省高三其他）某实验小组从五种香辛料中提取精油(编号为A、B、C、D、E)，并用这些精油对四种微生物进行了抑菌能力的实验研究，所得数据如下表所示。请回答ABCDE大肠杆菌21.126.015.124.023.2白葡萄球菌14.722.019.112.029.1
黑曲霉24.633.026.024.549.6青霉25.338.224.325.142.8（1）用萃取法从香辛料中提取精油时，采用的溶剂是___________，原理是____________。萃取的效率主要取决于萃取剂的______，同时还受温度和时间长短等条件的影响。（2）在探究精油对微生物的抑菌能力时，培养基中加入琼脂的作用是_________，采用_____法进行接种，实验结果表明，精油E对细菌的杀伤作用______（填大于或小于）对真菌的杀伤作用。（3）若要探究提取精油含量最高时的最佳萃取时间，请写出简要思路________。【答案】有机溶剂精油易溶于有机溶剂，而不溶于水性质和使用量作为凝固剂稀释涂布平板小于将萃取材料平均分成多组，在其他条件相同且适宜的情况下，分别进行不同时间萃取，测定精油含量，达到最大精油含量所用的最短时间即为最佳萃取时间【解析】【分析】1、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。2、植物芳香油的提取方法：蒸馏法、萃取法和压榨法等。（1）蒸馏法：芳香油具有挥发性。把含有芳香油的花、叶等放入水中加热，水蒸气能将挥发性较强的芳香油携带出来，形成油水混合物；冷却后，油水混合物又会重新分成油层和水层，除去水层便得到芳香油，这种提取方法叫蒸馏法。根据蒸馏过程中原料放置的位置的标准，将水蒸气蒸馏法划分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。（2）萃取法：这种方法需要将新鲜的香花等植物材料浸泡在乙醚、石油醚等低沸点的有机溶剂中，使芳香油充分溶解，然后蒸去低沸点的溶剂，剩下的就是芳香油。（3）压榨法：在橘子、柠檬、甜橙等植物的果皮中，芳香油的含量较多，可以用机械压力直接榨出，这种提取方法叫压榨法。【详解】
（1）用萃取法从香辛料中提取精油时，根据精油易溶于有机溶剂，而不溶于水的特点，应采用的溶剂是有机溶剂。萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受温度和时间长短等条件的影响。（2）在探究精油对微生物的抑菌能力时，实验用的培养基中需要加入琼脂，其作用是作为凝固剂，使液体培养基转化成固体培养基，方便测量抑菌圈直径；应采用稀释平板涂布法进行接种，以便形成较多的单个菌落；判断精油的抑菌能力大小的指标是抑菌圈直径大小，抑菌圈直径大则说明精油的杀伤作用大，实验结果表明，精油E对大肠杆菌、白葡萄球菌等细菌的抑菌圈直径小于对黑曲霉、青霉菌等真菌的抑菌圈直径，即其对细菌的杀伤作用小于对真菌的杀伤作用。（3）从香辛料中提取精油常用萃取法，萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受温度和时间长短等条件的影响。若要探究精油含量最高时的最佳萃取时间，简要思路是将萃取材料平均分成多组，在其他条件相同且适宜的情况下，分别进行不同时间萃取，测定精油含量，达到最大精油含量所用的最短时间即为最佳萃取时间。【点睛】本题考查微生物的培养和相关实验，要求考生识记接种微生物常用的两种方法，能正确分析表中数据，并从中提取有效信息答题，属于考纲识记和理解层次的考查。18．（2020·河北省高三其他）胡萝卜营养极为丰富，不仅是一种重要的食材，其含有一些具有药用价值的成分，如胡萝卜素可以用来治疗夜盲症等因缺乏维生素A引起的疾病，能使癌细胞恢复成正常细胞；胡萝卜籽油可驱蛔虫、治长久不愈的痢疾等。请根据所学知识，回答下列问题：（1）胡萝卜的种子含油量达13%，经水蒸气蒸馏可得到胡萝卜籽油，据此推测胡萝卜籽油具有_________等特点。（2）胡萝卜中所含的胡萝卜素主要是__________，可以用来它治疗维生素A缺乏症，是因为该种胡萝卜素__________________；提取的胡萝卜素粗品可通过__________法进行鉴定。（3）胡萝卜可生吃、炖煮，还可以制作成泡菜。①实验小组拟用含有碳酸钙的固体培养基（该培养基不透明，但碳酸钙被乳酸溶解后会变得透明）从陈泡菜水中分离出制泡菜用的乳酸菌：首先将少量用______稀释的陈泡菜水滴加到培养基表面，再用涂布器使陈泡菜水分布均匀；培养一段时间后，挑选出______________的菌落作为侯选菌。②制作的泡菜在食用前需要检测其中亚硝酸盐的含量，常用的测定方法是_________。【答案】难溶于水、挥发性强β–胡萝卜素（在人体小肠、肝脏等器官）可被氧化成维生素A纸层析无菌水具有透明圈比色法【解析】【分析】
胡萝卜素的提取：（1）胡萝卜素的性质：胡萝卜素是橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。（2）胡萝卜素的提取来源：提取天然胡萝卜素的方法主要有：一是从植物中提取；二是从大面积养殖的岩藻中获得；三是利用微生物的发酵生产。（3）萃取剂：最适宜作胡萝卜素萃取剂的是石油醚。（4）实验流程：胡萝卜→粉碎→干燥→萃取（石油醚）→过滤→浓缩→胡萝卜素→鉴定（纸层析法）。（5）胡萝卜素常用来治疗因缺乏维生素A引起的疾病；还是常用的食品色素；还具有使癌变细胞恢复为正常细胞的作用。【详解】（1）根据水蒸气蒸馏法的原理，推测胡萝卜籽油具有难溶于水、挥发性强等特点。（2）胡萝卜中所含的胡萝卜素主要是β–胡萝卜素，在人体小肠、肝脏等器官，一分子β–胡萝卜素被氧化生成两分子维生素A，因此胡萝卜可用来治疗维生素A缺乏症；鉴定提取的胡萝卜素粗品可使用纸层析法。（3）①由于陈泡菜液中乳酸菌的浓度高，难以分离得到单菌落，因此先用无菌水对陈泡菜液进行梯度稀释，使聚集在一起的乳酸菌分散开。由题意可知，分离纯化所用固体培养基因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙，从而在菌落周围产生透明圈（溶钙圈），分离纯化时应挑选出具有透明圈的菌落作为候选菌。②制作的泡菜在食用前需要检测其中亚硝酸盐的含量，常用的测定方法是比色法。【点睛】本题主要考查植物有效成分的提取、泡菜的制作以及微生物的实验室培养，考查学生的理解能力。19.（2020·云南省高三二模）猕猴桃味道酸甜，维生素C含量丰富，以猕猴桃果实为原料，制成的果汁及经发酵制成的果酒维生素C含量较高。请回答下列问题：（1）制作果汁时常加入果胶酶，因为果胶酶可以通过分解果胶来提高果汁的____________。由于溶液中的酶很难回收，为了降低成本，使果胶酶能被再次利用，一般采用化学结合法或____________法将其固定。（2）猕猴桃果酒制作时，发酵液未经过严格的灭菌处理，杂菌却不能正常生长，这是因为____________________________________________。
（3）科研人员发现某种微生物中富含果胶酶，通过酶解法和吸水涨破法释放出其中的果胶酶，分离该酶的方法有___________和电泳法，其中电泳法的原理是根据蛋白质分子的___________、大小以及形态不同，在电场中的_______________________不同而实现分离。（4）本实验中用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对所提取的酶进行鉴定。根据如图的电泳结果，某同学得出“所提取的酶具有两条链”的结论，这种说法可靠吗?理由是__________________________________。【答案】出汁率和澄清度物理吸附果酒发酵的无氧、pH呈酸性条件和代谢产生的酒精抑制了杂菌的生长凝胶色谱法带电性质差异（或带电情况）迁移速度不可靠，只能得出提取的蛋白质含有两种大小不同的肽链，不一定是两条【解析】【分析】1.果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，它包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶。产生果胶酶的生物有植物、霉菌、酵母菌和细菌等。果胶酶能够分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得容易，也是果汁变得澄清。2.凝胶色谱法： 凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一-些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进人凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进人凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。3.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。【详解】
（1）由分析可知，果胶酶能催化分解果胶，从而提高果汁的出汁率和澄清度。为了使果胶酶能被再次利用，通常采用固定化酶技术来实现果胶酶的重复利用，由于酶分子量小，因此通常采用化学结合法或物理吸附法将其固定。（2）酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵过程中产生的二氧化碳使得发酵液pH呈酸性，同时代谢产物酒精也能抑制杂菌，因此猕猴桃制成的发酵液在未经严格的灭菌处理的条件下，杂菌也不能正常生长。（3）科研人员发现某种微生物中富含果胶酶，由于微生物具有细胞壁，需要通过酶解法去壁，然后通过吸水涨破法释放出其中的果胶酶，再用凝胶色谱法和电泳法将果胶酶分离出来，其中电泳法的原理是根据蛋白质分子的带电性质差异（或带电情况）、大小以及形态不同，在电场中的迁移速度不同而实现分离。（4）利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的分子的迁移速率完全取决于分子量的大小，因此，结合如图电泳结果显示的两个聚集位点可知提取的蛋白质中含有两种大小不同的肽链，但不一定是两条，因此该同学结论不可靠。【点睛】熟知SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶色谱法分离蛋白质的原理是解答本题的关键！固定化酶技术以及酒精发酵的原理也是本题的考查点。四、固定化酶20．（2020·内蒙古自治区高三二模）苯氧基苯甲酸（3-PBA）是大多数拟除虫菊酯类农药降解的中间产物，毒性很大，科研人员研究了固定化3-PBA降解酶的固定条件，旨在为其工业应用提供参考。在本实验条件下，1min内使3-PBA减少1.0nmol所需酶量为1个酶活力单位（U）。（1）实验中科研人员选择海藻酸钠做为______________________________固定化酶，经过多次实验最终选择质量分数为2%的海藻酸钠溶液固定化酶，不选择浓度过低的海藻酸钠溶液的原因是______________，在实验中还发现：如果海藻酸钠的浓度_______________将很难形成凝胶珠。（2）用注射器吸取海藻酸钠和酶的混合液以恒定的速度滴加到_______________溶液中；根据下图结果显示固定化酶凝胶珠直径与针头型号成_______________相关；凝胶珠直径过大酶活力下降的原因可能是______________________________。
针头型号（3）检验凝胶珠的质量是否合格可以采用以下两种方法，一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果____________________________，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果_________________，也能表明制备的凝胶珠是成功的。【答案】包埋剂海藻酸钠浓度过低包埋酶液易渗出过高氯化钙正凝胶珠中心的酶难以接触底物，且反应产物难以排出凝胶珠不容易破裂，没有液体流出凝胶珠很容易弹起【解析】【分析】固定化酶是将酶（细胞）固定在不容易水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时固定在载体上的酶可以反复利用。【详解】（1）实验中科研人员选择海藻酸钠做为包埋剂固定化酶，经过多次实验最终选择质量分数为2%的海藻酸钠溶液固定化酶，不选择浓度过低的海藻酸钠溶液的原因是海藻酸钠浓度过低包埋酶液易渗出，如果海藻酸钠的浓度过高，将很难形成凝胶珠。（2）用注射器吸取海藻酸钠和酶的混合液以恒定的速度滴加到氯化钙溶液中以形成凝胶珠；由图可知随着针头型号增大，凝胶珠的直径增大，故固定化酶凝胶珠直径与针头型号成正相关；当凝胶珠直径过大时，凝胶珠中心的酶难以接触底物，且反应产物难以排出，所以凝胶珠直径过大，酶活力下降。（3）检验凝胶珠的质量是否合格可以采用以下两种方法，一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。【点睛】
本题考查固定化酶的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力。
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