第34讲 基因工程考点1 基因工程的操作工具1．基因工程的概念2．限制性核酸内切酶(限制酶)3．DNA连接酶
4．载体1．(选修3P6“寻根问底”改编)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。答案：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。2．(选修3P6“旁栏思考题”)想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？答案：能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等。1．(2018·高考北京卷)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图2中酶切产物可用于构建重组DNAC．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA解析：选D。不同的限制酶识别序列不同，A项正确；限制酶切割的产物可用于构建重组DNA，B项正确；泳道①显示四个条带，是SalⅠ处理后的酶切产物的电泳结果，泳道②
显示三个条带，是XhoⅠ处理后的酶切产物的电泳结果，C项正确；限制酶的作用特点是识别特定DNA序列，并在DNA两条链特定部位切割产生黏性末端或平末端，D项错误。2．(高考全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是________________________________。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是________________________________________________________________。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_________和_________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。解析：(1)由题图(a)可知，尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与题图(b)中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端，而E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端。答案(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
1．限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，如图乙)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能进行自主复制。2．载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以筛选出转入载体的受体细胞，原理如下图所示：1．(2020·江苏南京、盐城模拟)下列关于生物学中常见的几种酶的叙述，正确的是( )A．DNA连接酶将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间的碱基黏合B．用限制性核酸内切酶从质粒上切下一个目的基因需消耗4个水分子C．Taq酶是PCR仪扩增DNA分子时常用的一种耐高温的DNA连接酶D．在解离根尖分生区细胞时加入纤维素酶有利于提高解离的效果解析：选B。黏性末端与黏性末端之间的互补配对的碱基自动形成氢键，DNA
连接酶催化形成磷酸二酯键，A错误；切下一个目的基因需要打开2个切口，水解4个磷酸二酯键，故需消耗4个水分子，B正确；Taq酶是耐高温的DNA聚合酶，C错误；对根尖分生区细胞进行解离时用解离液处理，不需要纤维素酶，D错误。2．(不定项)下列有关基因工程相关工具的叙述，正确的是( )A．限制酶能识别并切割DNA任意序列B．DNA连接酶与Taq酶的作用位点不同C．没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞D．使用质粒载体可以避免目的基因在受体内被分解解析：选CD。限制酶具有特异性，能识别DNA上特定序列并切割；DNA连接酶与Taq酶的作用位点都是磷酸二酯键；进入受体细胞的有普通质粒和重组质粒；质粒的特点之一是能够在宿主细胞内稳定存在，故将目的基因与质粒重组可以避免目的基因在受体内被分解。3．(不定项)下列物质或过程可能影响磷酸二酯键数目变化的是( )A．限制性核酸内切酶B．构建基因表达载体C．遗传信息的翻译D．染色体的结构变异解析：选ABD。DNA中含有磷酸二酯键，限制性核酸内切酶可以断裂磷酸二酯键，使磷酸二酯键数目减少，A符合题意；构建基因表达载体指将目的基因与运载体连接，磷酸二酯键数目会增加，B符合题意；遗传信息的翻译产物是蛋白质，不涉及磷酸二酯键数目的变化，C不符合题意；染色体包括DNA和蛋白质，染色体的结构变异分为染色体片段的缺失、重复、易位、倒位，其中缺失、重复、易位会导致DNA片段的数目改变，则磷酸二酯键数目会发生变化，D符合题意。4．(2020·山东章丘检测)人体的细胞内含有抑制癌症发生的p53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。(1)目的基因的获取方法通常包括__________________________、利用PCR技术扩增目的基因和________________________。(2)已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的p53基因部分区域(见上图)，那么正常人的会被切成________个片段，而患者的则被切割成长度为________对碱基和________对碱基的两个片段。
解析：(1)目的基因的获取方法通常有从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因和通过化学方法人工合成目的基因三种。(2)正常人p53基因部分区域有两个限制酶E的识别序列，完全切割后可产生三个片段，患者p53基因部分区域中有一个限制酶E的识别序列发生突变，这样患者就只有一个限制酶E的识别序列，切割后产生两个片段，分别为290＋170＝460(对)碱基和220对碱基。答案：(1)从基因文库中获取目的基因 通过化学方法人工合成目的基因 (2)3 460 2205．(2021·预测)下图所示为pBR322质粒，其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环素抗性基因)为标记基因，ori为复制原点，其他均为限制酶及其识别位点，并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载体。回答下列相关问题：(1)制备重组质粒，需要限制酶和________酶。如制备重组质粒时，使用PvuⅠ切割该质粒，则检测目的基因是否导入受体细胞，需要在培养基中添加________。(2)该质粒中的BamHⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为，而Sau3AⅠ识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamHⅠ和Sau3AⅠ分别切割DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DNA链，则Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为________。该拼接在一起的DNA片段，________(填“能”“否”或“不一定”)被BamHⅠ识别。(3)与图示质粒相比，完整的重组质粒中还应有________________________等三种特殊的DNA片段。将重组质粒导入动、植物细胞的方法分别为__________________，如受体细胞为大肠杆菌，则该菌经钙离子处理后，将具备______________的特性。解析：(1)基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA连接酶。使用PvuⅠ切割pBR322质粒会破坏ampr(氨苄青霉素抗性基因)而tetr(四环素抗性基因)不受破坏，所以可用含有四环素的培养基来筛选具有目的基因的细胞。(2)据题可知，Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及其切割位点为，这样Sau3AⅠ和BamHⅠ切割DNA时才能形成相同的黏性末端，进而能拼接成一条DNA链。重新拼接的核苷酸序列不一定是—GGATCC—，因此不一定能被BamHⅠ识别，但一定能被Sau3AⅠ识别。(3)一个完整的重组质粒有标记基因、目的基因、启动子、终止子和复制原点等特殊片段。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，而导入动物细胞的方法有显微注射法。钙离子处理后的大肠杆菌，将处于感受态，该状态的细胞具有将外界DNA吸入细胞的特性。
答案：(1)DNA连接 四环素 (2) 不一定(3)启动子、终止子和目的基因 显微注射法，农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法(后者答出一个即可) 将外界DNA吸入细胞考点2 基因工程的基本操作1．目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。(2)获取方法2．基因表达载体的构建——基因工程的核心3．将目的基因导入受体细胞项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法转化法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞中染色体的DNA上→表基因表达载体↓显微注射受精卵↓发育Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
达新性状个体4.目的基因的检测与鉴定1．(2019·高考江苏卷)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是( )A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗解析：选D。A项、B项和C项均采用了基因工程技术，基因工程依据的原理是基因重组，且参与繁殖的细胞中均含有目的基因，故可遗传给子代，A项、B项、C项不符合题意；D项也采用了基因工程技术，但只有患者的淋巴细胞中含有目的基因，患者的生殖细胞中不含目的基因，故不能遗传给子代，D项符合题意。2．(2019·高考全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________。解析：(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR反应过程中，要加热至90～95℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。答案：(1)基因组文库 cDNA文库(2)解旋酶 加热至90～95℃ 氢键(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活3．(2019·高考江苏卷)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
(1)EcoRⅤ酶切位点为，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为___________末端。(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________、________。菌落类型平板类型 ABC无抗生素＋＋＋氨苄青霉素＋＋－四环素＋－－氨苄青霉素＋四环素＋－－(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是____________________________________________。解析：(1)EcoRⅤ酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoRⅤ酶识别的序列及切割位点，
所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P0质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50bp＋300bp＋100bp＝450bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P0质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300bp＋100bp＝400bp的片段。答案：(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接1．基因组文库与部分基因文库的比较项目基因组文库部分基因文库(cDNA文库)构建基因文库的过程某种生物全部DNA↓限制酶许多DNA片段分别与载体↓连接导入受体菌群体某种生物发育的某个时期的mRNA↓反转录cDNA与载体↓连接导入受体菌群体其他区别①含某种生物全部基因；②有启动子、有内含子；③部分可与其他生物基因交流①含该种生物“部分”基因；②无启动子、无内含子；③均可与其他生物基因交流2.PCR技术(1)原理：DNA复制。(2)PCR反应过程过程说明图解变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链复性温度下降到50℃左右，
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸(3)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的指数形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。3．四类受体细胞的筛选与判定当用相应的限制酶切割了目的基因与载体后，可将二者混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化受体细胞，其结果有如下四种：上述四类受体细胞中通过“标记基因”(制备的培养基)可区分出(1)(2)与(3)(4)，而通过DNA分子杂交技术，可进一步区分(3)与(4)。1．农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的载体，下列相关叙述正确的是( )A．Ti质粒是能够自主复制的单链DNA分子B．Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接C．重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞D．Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上解析：选B。Ti质粒是能够自主复制的环状双链DNA分子，其分子内部的磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接，A错误，B正确；重组Ti质粒的受体细胞可以是植物愈伤组织细胞，也可以是植物的其他细胞，C错误；农杆菌有Ti质粒，Ti质粒上有一段TDNA，目的基因可插入Ti质粒上的TDNA中，从而导入农杆菌，让农杆菌侵染植物，农杆菌的Ti质粒上的TDNA片段(内有目的基因)整合到受体细胞的染色体上，即只有Ti质粒上的TDNA片段(内有目的基因)可整合到受体细胞染色体上，而不是Ti质粒上的全部基因，D错误。2．(2020·山东省高三等级考模拟)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)与脱氧核苷三磷酸(dNTP)的结构如图所示。已知ddNTP按
碱基互补配对的方式加到正在复制的子链中后，子链的延伸立即终止。某同学要通过PCR技术获得被32P标记且以碱基“C”为末端的、不同长度的子链DNA片段。在反应管中已经有单链模板、引物、DNA聚合酶和相应的缓冲液等，还需要加入下列哪些原料( )①dGTP、dATP、dTTP、dCTP ②dGTP、dATP、dTTP③α位32P标记的ddCTP④γ位32P标记的ddCTPA．①③ B．①④ C．②③ D．②④解析：选A。本题中实验的目的是获得32P标记的、不同长度的、以碱基“C”为末端的子链DNA片段，因此需要保证PCR反应中子链延伸的步骤能够正常进行，同时用ddNTP使子链能在碱基“C”出现的地方停止复制。为了达到上述两个目的，首先需要加入保证复制正常进行的四种dNTP，故选①；其次需要加入ddCTP使子链在碱基“C”出现的地方停止复制，由于在复制进行时，γ位的磷酸基团会脱去，因此ddCTP的标记位点不能选择γ位，故选③。综上所述，正确的组合是①③。3．(不定项)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是( )A．过程①需使用逆转录酶B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞解析：选AD。过程①表示利用mRNA通过逆转录法合成目的基因，逆转录过程中需要逆转录酶的催化，A正确；过程②表示利用PCR技术对目的基因进行扩增，该过程中不需要利用解旋酶，解旋是通过高温实现的，B错误；感受态细胞法利用的是CaCl2溶液，C错误；过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞，D正确。4．(2020·广东高三模拟)烟草易受烟草花叶病毒(TMV)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染，研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如下图所示。请回答下列问题：
(1)过程①所用RNA可以从____________中获取。(2)过程②可以采用_________技术获得大量目的基因，该技术的实质是___________。(3)过程④最常用的方法是________，该方法中需将目的基因插入受体细胞的________上。(4)过程⑤所用到的培养基除了卡那霉素之外，还需要加入的特殊物质是____________。过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定，在分子水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是________________________。解析：(1)据题图可知，①表示逆转录过程，其模板RNA逆转录形成的DNA中含有目的基因(抗TMV基因)，因此该RNA可以从绞股蓝细胞的细胞质基质中提取。(2)过程②表示获取目的基因的过程，利用PCR技术可以大量扩增目的基因，PCR技术的原理是双链DNA的复制。(3)过程④表示将目的基因导入受体细胞的过程，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，该方法可将目的基因插入受体细胞的染色体DNA上。(4)过程⑤表示植物组织培养过程，此过程需要在培养基中加入植物激素，如细胞分裂素和生长素。过程⑥表示目的基因的检测与鉴定过程，对于产生的蛋白质可以采用抗原—抗体杂交法进行检验。答案：(1)绞股蓝细胞的细胞质基质(2)PCR(或多聚酶链式反应) 双链DNA的复制(3)农杆菌转化法 染色体DNA(4)植物激素(或生长素和细胞分裂素) 抗原—抗体杂交法5．(2021·预测)科学家利用植物生产药用蛋白，研究出了用转基因马铃薯生产人的血清白蛋白的方法。下图表示EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶在质粒上的切割位点，两种酶识别和切割位点见表。回答下列相关问题：限制酶识别序列和切割位点EcoRⅠG↓AATTCBamHⅠG↓GATCC(1)该工程中适宜用来切割质粒的限制酶是________，原因是_____________________。(2)获取血清白蛋白基因可以利用反转录法构建的________文库中获取，若利用PCR技
术扩增血清白蛋白基因，设计引物序列的主要依据是____________________，还需要在引物的一端加上________________序列，以便于后续的剪切和连接。(3)将目的基因和质粒进行连接后，需先用________处理农杆菌以便将基因表达载体导入马铃薯细胞，筛选含有目的基因的细胞需在培养基中添加________________________。(4)从含有血清白蛋白基因的马铃薯细胞中提取血清白蛋白，需通过________过程培养得到愈伤组织，从其中提取有效成分。解析：(1)限制酶切割时必须保证至少一个标记基因的完整性，故不能选择用EcoRⅠ切割，只能选择用BamHⅠ切割目的基因和载体。(2)反转录法构建的是部分基因(cDNA)文库，PCR扩增的原理是双链DNA的复制，需要根据目的(血清白蛋白)基因两端的部分核苷酸序列合成2种引物，还需要在引物一端加上BamHⅠ的识别序列GGATCC，以便于限制酶的切割和DNA连接酶的连接。(3)在农杆菌转化法中，要在将基因表达载体导入农杆菌细胞前，用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态。然后再让含目的基因的农杆菌去感染马铃薯细胞，进而把目的基因转入马铃薯细胞中，因为基因表达载体中含有抗氨苄青霉素基因，故可以在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选。(4)马铃薯细胞需要经过脱分化培养至愈伤组织阶段，即可提取细胞产物血清白蛋白。答案：(1)BamHⅠ 用EcoRⅠ切割会将质粒上的两个抗性基因都破坏 (2)cDNA 目的(血清白蛋白)基因两端的部分核苷酸序列 GGATCC (3)Ca2＋ 氨苄青霉素 (4)脱分化考点3 基因工程的应用与蛋白质工程1．基因工程的应用(1)(2)(3)
(4)2．蛋白质工程1．(2017·高考全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_________________________________________________________________。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_____作为载体，其原因是______________________________________________。(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__________________________(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________________________________________________________________。解析：(1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，
但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体；噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原—抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体2．(高考全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰_______基因或合成____________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_________________________________。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。解析：(1)据题可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：由上图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→
设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能1．基因治疗≠基因诊断项目原理操作过程进展基因治疗基因表达将正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)临床试验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用2.蛋白质工程与基因工程的关系项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程；②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造1．(2020·江苏徐州高三月考)中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境，以下说法错误的是( )A．该工程可以定向改变蛋白质分子的结构B．改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的C．改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种D．改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质解析：选D。蛋白质工程可以定向改造蛋白质分子的结构，A正确；改造蛋白
质是通过改造基因结构而实现的，B正确；改造后的中华鲟具有新的性状，但其和现有中华鲟仍是同一物种，C正确；蛋白质工程改造的是基因，基因可以遗传给子代，因此改造后的中华鲟的后代也具有改造的蛋白质，D错误。2．(不定项)科学家利用生物技术将人的生长激素基因导入小鼠受精卵的细胞核中，经培育获得一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中，在医学研究及相关疾病治疗方面都具有重要意义。下列有关叙述正确的是( )A．选择受精卵作为外源基因的受体细胞是因为这种细胞具有全能性B．采用DNA分子杂交技术可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达C．人的生长激素基因能在小鼠细胞内表达，说明遗传密码在不同种生物中可以通用D．将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代解析：选ACD。选择受精卵作为外源基因的受体细胞是因为这种细胞具有全能性，而且全能性最高，A正确；采用DNA分子杂交技术可检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，但不能检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达，B错误；人的生长激素基因能在小鼠细胞内表达，说明遗传密码在不同种生物中可以通用，C正确；将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代，D正确。3．(不定项)SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。研制预防SARS病毒的疫苗简要的操作流程如下，下列有关叙述正确的是( )A．步骤①所代表的反应过程是逆转录B．将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，也能得到表达的S蛋白C．步骤③和⑤常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法D．可用抗原—抗体杂交法检测细胞中是否真正成功表达了病毒S蛋白解析：选AD。分析题图，图中步骤①表示RNA到DNA的过程，为逆转录的过程，A正确；S基因必须先与载体构建成重组载体后，才能导入大肠杆菌，从而表达出S蛋白，B错误；步骤③是将基因表达载体导入大肠杆菌，此过程常用的方法是用Ca2＋处理大肠杆菌使之成为感受态细胞，⑤常用显微注射法，C错误；若检测S蛋白，则可利用抗原—抗体杂交法，若有杂交带出现，表明S蛋白基因已表达出S蛋白，D正确。4．(2020·河南中原名校高三质检)干旱会影响农作物产量，科学家们对此进行了研究。下图为用基因探针检验某一抗旱植物基因型的原理，相关基因用R和r表示，回答下列问题：
(1)在利用PCR技术扩增R或r基因的过程中，利用________可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。(2)若被检植株发生A现象，不发生B、C现象。据此推测检测另一抗旱植物时会发生________(填“A”“B”或“A或B”)现象。(3)用从基因文库中获取目的基因的方法获取抗旱基因时需要用到限制酶，限制酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________断开。(4)经检测，抗旱基因已经导入烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是____________________________________。(5)要快速繁殖转基因抗旱烟草植株，目前常用的技术是__________，该技术的基本过程是将离体的烟草细胞诱导脱分化形成___________，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是突变体的利用和___________________。解析：(1)用PCR技术扩增R或r基因时，需要用引物寻找抗旱基因的位置。(2)被检植株发生A现象，不发生B、C现象，即r探针没有形成杂交斑，所以被检植物的基因型应为RR。因此另一抗旱植物的基因型应为RR或Rr，据题图分析可发生A或B现象。(3)限制酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。(4)经检测，抗旱基因已经导入烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是基因表达载体上目的基因首端未加入启动子。(5)植物组织培养技术可快速繁殖抗旱烟草植株，该技术包括脱分化和再分化两个基本过程，其中先将离体的烟草细胞诱导脱分化形成愈伤组织，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是突变体的利用和单倍体育种。答案：(1)引物 (2)A或B (3)磷酸二酯键 (4)基因表达载体上目的基因首端未加入启动子 (5)植物组织培养技术 愈伤组织 单倍体育种5．(2020·安徽宣城模拟)转基因技术的应用大大提高了动植物的品质，下图是绿色荧光蛋白转基因克隆猪培育示意图，据图回答下列问题：
(1)过程①需要的工具酶有______。绿色荧光蛋白基因需要导入成纤维细胞的________上才有可能培育出绿色荧光蛋白转基因克隆猪。(2)猪胎儿成纤维细胞培养过程中，为了防止培养过程中的污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的________。(3)通过过程⑤将早期胚胎移植到受体母猪体内能存活的原因是_________________。(4)若是想在短期内获得更多的相同的绿色荧光蛋白转基因克隆猪该如何做？________________________________________________________________________。(5)科学家将反义F3H序列导入康乃馨中，降低了植株中F3H基因的表达量和酶活性，封锁了花青素合成途径，获得了花香物质苯甲酸的释放量大大增加的转基因康乃馨。以上说明目的基因除了编码蛋白质的基因外，还可以是________________。将目的基因导入植物细胞常用的方法是________________。解析：(1)题图中过程①表示基因表达载体的构建，过程②表示超数排卵处理，过程③是核移植过程，过程④是早期胚胎培养，过程⑤是胚胎移植过程，最后通过妊娠分娩获得绿色荧光蛋白转基因克隆猪。构建基因表达载体时，需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶。绿色荧光蛋白基因需要导入成纤维细胞的染色体DNA上才有可能培育出绿色荧光蛋白转基因克隆猪。(2)猪胎儿成纤维细胞培养过程中，培养液中通常加入抗生素，其目的是防止培养液被污染。(3)早期胚胎移植时，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体母猪体内存活提供了可能。(4)来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，所以将早期胚胎进行胚胎分割移植可以获得更多相同的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。(5)科学家将反义F3H序列导入康乃馨中，降低了植株中F3H基因的表达量和酶活性，封锁了花青素合成途径，获得了花香物质苯甲酸的释放量大大增加的转基因康乃馨。以上说明目的基因除了编码蛋白质的基因外，还可以是调控作用因子。因为导入的对象是植物细胞，而土壤中的农杆菌易侵染植物细胞，故一般用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。答案：(1)限制酶和DNA连接酶 染色体DNA (2)抗生素 (3)受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应 (4)对早期胚胎进行分割移植 (5)调控作用因子 农杆菌转化法
考点4 DNA的粗提取与鉴定1．实验原理(1)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同项目溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白质NaCl溶液物质的量浓度从2mol/L逐渐降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大部分发生盐析沉淀溶解(2)DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。(3)DNA与二苯胺沸水浴加热，呈蓝色。2．操作流程材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织破碎细胞(以鸡血为例)：去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管置于沸水中加热5min，溶液变成蓝色DNA的粗提取与鉴定中的“2、4、4”加蒸馏水2次①加到血细胞中，使血细胞吸水破裂；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14mol/L，使DNA析出用纱布过滤4次①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液，取滤液；③滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA1．下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析回答下列问题：(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2mol/LNaCl的目的是什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案：(1)不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14mol/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质(2)②中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质。这时候搅拌要沿一个方向，轻缓地进行(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的。加入2mol/L的NaCl溶液的目的是使DNA再次溶解2．实验中对DNA进行鉴定时，有如下操作。据图表回答下列问题：试管序号 AB1加2mol/L的NaCl溶液5mL加2mol/L的NaCl溶液5mL2不加加入提取的DNA丝状物并搅拌
3加4mL二苯胺，混匀加4mL二苯胺，混匀4沸水浴5min沸水浴5min实验现象________________________实验结论________________________(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？________________________________________________________________________。(3)在沸水浴中加热的目的是______________________，同时说明DNA对高温有较强的________。(4)A试管在实验中的作用是________。(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________有关。解析：A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含DNA丝状物，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。答案：(1)溶液不变成蓝色 溶液逐渐变成蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会变成蓝色(2)溶液颜色基本不变(3)加快颜色反应速度 耐受性(4)对照(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少[易误警示]易错点1 误认为目的基因的插入位点是“随机”的[点拨] 目的基因的插入位点不是随机的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。易错点2 误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”[点拨] (1)在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，
以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。易错点3 混淆启动子与起始密码子，终止子与终止密码子，不明确标记基因的作用[点拨] 启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子。(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。(2)终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。(3)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。易错点4 误认为基因工程可导致受体细胞或生物产生“新基因”或“新蛋白质”[点拨] 基因工程的实质是“基因重组”，它是将外源基因导入受体细胞，使该基因在受体细胞中表达——由于“外源基因”是自然界已存在的“现成”基因，故基因工程并未产生新基因，因此目的基因表达时也未产生新蛋白质，基因工程只不过是让受体细胞(或生物)实现了“外源基因的表达”。[纠错体验]1．在基因工程中，可依据受体细胞的类型及其生理特性来选择合适的载体，既能高效地携带目的基因进入受体细胞，又能方便地进行检测。已知有以下几类含有不同标记基因的质粒，不可作为侵入大肠杆菌的载体的是(已知青霉素可杀死细菌，四环素不能杀死大肠杆菌)( )解析：选B。A质粒携带的目的基因是否进入大肠杆菌，可用含有青霉素的培养基培养大肠杆菌，如果大肠杆菌不死亡，说明这些大肠杆菌已含有了A质粒上的标记基因表达出的性状，进一步说明目的基因已被携带进入大肠杆菌细胞内。B质粒作载体导入大肠杆菌，无论大肠杆菌含有抗四环素基因与否，都能在含四环素的培养基上生长，所以不能用于检测目的基因是否进入大肠杆菌。C和D质粒上的标记基因均可明显指示目的基因是否进入大肠杆菌细胞内。2．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花的染色体上解析：选C。目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来，A项正确；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法，B项正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素，C项错误；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上，D项正确。3．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( )A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用解析：选C。人肝细胞中胰岛素基因不表达，因而不存在胰岛素mRNA，A错误。复制原点是基因表达载体复制的起点，而胰岛素基因表达的起点是启动子，B错误。借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来，C正确。启动子与RNA聚合酶结合启动转录过程，终止密码子是翻译的终止信号，D错误。4．(不定项)下列关于基因工程的应用，错误的是( )A．抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达B．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中C．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达D．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构答案：BCD1．(2020·江苏徐州考前模拟)下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( )A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同
B．PCR中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关C．在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体D．质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上并表达解析：选C。不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同，A错误；PCR中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，B错误；在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高，C正确；质粒本身也是DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到体细胞的DNA上并表达，D错误。2．实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是( )A．95℃时DNA的磷酸二酯键断开B．引物与模板结合后向5′方向延伸C．反应过程包括变性→复性→延伸D．需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶解析：选C。95℃时DNA的氢键断开，A错误；引物与模板结合后向3′方向延伸，B错误；反应过程包括变性→复性→延伸，C正确；PCR技术通过高温解旋，不需要解旋酶，D错误。3．在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是( )A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞B．用选择培养基筛法导入目的基因的细胞C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合D．用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽解析：选C。农杆菌侵染细菌是基因工程中常常用到的把目的基因导入植物细胞的方法，A正确；目的基因是否导入了细胞，需要在选择培养基上进行筛选，B正确；在植物细胞组织培养的过程中，需要调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，来达到对其脱分化和再分化的控制，D正确；在农杆菌侵染植物细胞的过程中并没有涉及原生质体的融合，C错误。4．下列关于核酸分子杂交和抗原—抗体杂交的叙述，正确的是( )A．核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交B．抗原—抗体杂交的原理为碱基互补配对原则C．核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录D．抗原—抗体杂交常以目的基因产物作为抗体解析：选C。核酸分子杂交可以是两条脱氧核苷酸链的杂交，也可以是DNA单链和RNA的杂交；抗原—抗体杂交的原理是抗体能与对应的抗原发生特异性结合；核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录；抗原—抗体杂交中目的基因的产物常作为抗原。5．(不定项)下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因D．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建解析：选ABC。限制酶的识别序列多为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，A错误；PCR反应中，起初的90～95℃高温是使目的基因解旋，后冷却至50℃左右是使引物结合到互补DNA链上，最后再加热至72℃左右是让DNA聚合酶催化DNA的子链延伸，B错误；载体质粒上的四环素抗性基因、青霉素抗性基因等抗生素抗性基因常作为标记基因，C错误；基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，D正确。6．(不定项)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是( )A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞解析：选BD。本题主要考查PCR技术的有关知识。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物，但不需知道目的基因的全部序列，需要考虑载体的序列；因PCR反应在高温条件下进行，故反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶；因某些目的基因编码的产物需经特殊的加工修饰过程，故一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞。7．(不定项)(2020·山东威海模拟)下列关于DNA重组技术基本工具的叙述，正确的是( )A．天然质粒须经过人工改造后才能作为载体B．限制酶和DNA连接酶分别催化磷酸二酯键的水解和形成C．一个基因表达载体除了有目的基因外，还必须有起始密码子、终止密码子以及标记基因等D．DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸结合到引物链上解析：选AB。天然质粒不完全符合载体的要求，通常须经过人工改造后才能作为载体，A正确；限制酶识别特定的核苷酸序列并在特定的位点切割，使磷酸二酯键水解，DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两个DNA片段连接起来，不能将单个脱氧核苷酸结合到某一DNA片段上，B正确，D错误；基因表达载体需要有复制原点、启动子、终止子、目的基因和标记基因，C错误。8．(2020·江西重点中学盟校一模)回答下列与基因工程有关的问题：
(1)基因工程技术中，______________是将目的基因导入植物细胞最常用的方法，其中的Ti质粒上的TDNA是指____________________。(2)获得的目的基因可利用PCR技术在体外反应体系中扩增，该过程利用的原理是____________，需要加入的原料是__________，DNA解旋利用的是________原理。(3)基因工程中使用的载体，除质粒外，还有_____________和____________。(4)该技术可以培育抗病转基因植物，也可用于动物的基因治疗。与之相比，单克隆抗体也用于诊断或携带药物治疗癌症，这是利用了它___________________________的优点。解析：(1)将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，其中的Ti质粒上的TDNA是指可转移的DNA。(2)PCR技术利用的原理是DNA双链复制，需要的原料是dATP、dTTP、dCTP和dGTP。DNA解旋利用的是热变性原理，即DNA受热变性(或高温变性)后解旋为单链。(3)基因工程中使用的载体，除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(4)单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的优点，可用于诊断或携带药物治疗癌症。答案：(1)农杆菌转化法 可转移的DNA (2)DNA双链复制 四种脱氧核苷酸(或dATP、dTTP、dCTP和dGTP) 热变性(或高温变性等类似意思) (3)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒(两空可调换) (4)特异性强、灵敏度高9．(高考全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_______________________；并且____________和____________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料
来自____________。解析：(1)作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，且含有特殊的标记基因。(2)未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分。据题图可知，用BamHⅠ切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其DNA复制所需原料来自受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞10．(2020·广东肇庆模拟)含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题：(1)目前，基因工程中使用的______________主要是从原核生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是____________(填“基因组文库”“cDNA文库”或“基因组文库和cDNA文库”)。(2)含有某种限制酶的细胞，可以利用该限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA，其原因可能有①________________________________________________________________________；②________________________________________________________________________。(3)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90～95℃)、低温复性(55～60℃)、适温延伸(70～75℃)三个步骤构成一个循环，为使得酶能够重复利用，选用的酶应在90～95℃处理后仍然具备催化活性，因此应选用____________________酶。(4)在PCR扩增目的基因时，为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记，反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的________(填“腺嘌呤核糖核苷酸”“dATP”或“ATP”)。解析：(1)基因工程中的限制酶主要是从原核生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中都需要利用DNA连接酶将DNA片段与载体连接导入受体菌群储存，只不过两者使用的DNA片段不同，cDNA文库是利用反转录法获得的DNA(部分基因)，基因组文库使用的是某种生物的全部DNA(全部基因)。(2)原核细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列或者甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰，这使含有某种限制酶的原核细胞，可以利用该限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的
DNA。(3)PCR扩增目的基因的三个步骤是高温变性(90～95℃)、低温复性(55～60℃)和适温延伸(70～75℃)，该过程使用的DNA聚合酶需是热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。(4)在PCR扩增目的基因时，使用的原料是dATP、dTTP、dCTP和dGTP。答案：(1)限制酶(或限制性核酸内切酶) 基因组文库和cDNA文库 (2)①细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列 ②甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰 (3)热稳定DNA聚合(Taq) (4)dATP11．(2018·高考全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端。获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________，使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。解析：(1)据题图可知，将L1GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1GFP融合基因的完整，又能保证L1GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。答案：(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接(2)转录 翻译(3)细胞核 去核卵母细胞(4)核DNA12．(2020·广东肇庆一模)2018年10月3日，“不务正业”
的诺贝尔化学奖又颁给了生物学，授予了格雷戈里·温特(GregoryP．Winter)等3位科学家，以表彰他们在酶的定向进化，肽类和噬菌体展示技术等方面的成绩。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。请根据材料回答下列问题：(1)T2噬菌体的遗传物质是____________，如噬菌体外壳蛋白展示胰岛素蛋白原，构建基因表达载体时，胰岛素基因前还要插入____________。(2)将外源蛋白或多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因中，需要用到的工具酶有______________。噬菌体外壳蛋白结构基因用EcoRⅠ切割后产生的片段如下图：图示末端为____________，为使外源蛋白DNA序列能与其相连，外源蛋白DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种酶切割，该酶必须具有的特点是______________________。(3)从物质基础来看，不同生物之间能够进行基因重组，原因是____________________。(4)格雷戈里·温特发明了“拟人化”和全拟人化的噬菌体展示技术，并开发了制造人源化抗体以及在细菌中重组表达人源抗体的技术，这一技术解决了单克隆抗体传统的制备过程中需要将____________和____________相融合的需求。单克隆抗体常应用于分子靶向治疗，其特点是________________________________________________________________________。解析：(1)T2噬菌体是一种DNA病毒，其遗传物质是DNA。如噬菌体外壳蛋白展示胰岛素蛋白原，构建基因表达载体时，胰岛素基因前还要插入该基因的启动子。(2)构建基因表达载体时，首先需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA和运载体，其次还需要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA。EcoRⅠ切割后产生的末端为黏性末端。为使外源蛋白DNA序列能与其相连，外源蛋白DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种酶切割，但该酶切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的DNA片段末端应相同，否则无法连接。(3)不同生物之间能够进行基因重组的原因是DNA都是由四种脱氧核苷酸组成的。(4)单克隆抗体传统的制备过程中需要将骨髓瘤细胞和已免疫的效应B细胞相融合。单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。答案：(1)DNA (胰岛素基因)启动子 (2)限制酶和DNA连接酶 黏性末端 切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的DNA片段末端相同 (3)DNA都是由四种脱氧核苷酸组成的 (4)骨髓瘤细胞 已免疫的效应B细胞 特异性强、灵敏度高、可大量制备
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