考点75蛋白质的提取与分离高考频度：★★☆☆☆难易程度：★★★☆☆1．蛋白质提取与分离的依据分子的形状、大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力。2．凝胶色谱法（1）材料：凝胶多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（2）步骤：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3．缓冲溶液（1）概念：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。（2）作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。（3）配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。（4）本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4)，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。4．电泳法（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（3）类型：琼脂糖凝胶电泳法：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。5．实验操作实验操作的基本步骤：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。（一）样品处理（1）红细胞的洗涤：①目的：去除杂蛋白。②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。③所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。试管中的溶液分为4层，从上往下依次是：①无色透明的甲苯层。②白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。③红色透明液体：血红蛋白溶液层。④暗红色沉淀层：红细胞破碎物沉淀。（4）透析：①方法：取1mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12h。②目的：去除样品中分子量较小的杂质。③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。（二）凝胶色谱操作（1）凝胶色谱柱的制作制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管。（2）凝胶色谱柱的装填①材料：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在。然后用300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密。
（3）样品的加入和洗脱使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。考向一蛋白质提取与分离的方法及原理1．下列有关提取和分离猪血红蛋白的实验，叙述错误的是A．用生理盐水洗涤红细胞，以防止红细胞破裂B．用蒸馏水和甲苯处理红细胞，使其释放出血红蛋白C．用生理盐水透析血红蛋白溶液，以保持血红蛋白活性D．用磷酸缓冲液洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动【参考答案】C【试题解析】A、生理盐水的浓度与红细胞的细胞质的浓度相当，在生理盐水中，红细胞能维持正常的形态，因此用生理盐水洗涤红细胞，可以防止红细胞破裂，A正确；B、红细胞释放血红蛋白，需加入蒸馏水和40%的甲苯，再在磁力搅拌器上充分搅拌10min，在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白，B正确；C、将盛有血红蛋白溶液的透析袋放入一定浓度的磷酸缓冲液中透析，C错误；D、磷酸缓冲液可维持血红蛋白的正常特性，用磷酸缓冲液洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动，D正确。2．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是
A．若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中
B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．将样品装入透析袋中透析12h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远【答案】A【解析】丙的分子量比戊要大，因此若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中，A正确；分析题图可知，甲分子量最小，如果用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，甲很容易进入凝胶内部的通道，路程最长，移动的速度最慢，B错误；分析题图可知，与乙相比丙的分子量较大，如果将样品装入透析袋中透析12h，若分子丙保留在袋内，乙不一定保留在袋内，C错误；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的迁移速率完全取决于分子大小，甲和丙之间分子量相差最大，因此二者之间的电泳带相距最远，D错误。考向二蛋白质提取与分离的实验操作3．下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞C．血红蛋白释放后应低速短时间离心D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液【参考答案】A【试题解析】A、猪是哺乳动物，其成熟的红细胞没有细胞核和众多细胞器，含有大量的血红蛋白，可采集猪血作为实验材料，A正确；B、用生理盐水重复洗涤红细胞，B错误；C、血红蛋白释放后应中速长时间离心，C错误；D、血红蛋白为有色蛋白，分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，D错误。易错警示
1．红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2．色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3．凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。4．色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。4．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。（1）将实验流程补充完整：A为________，B为________。凝胶色谱法是根据____________而达到蛋白质分离的有效方法。（2）洗涤红细胞的目的是去除_________，洗涤次数过少，无法除去_________；离心速度过高和时间过长会使_______一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是__________。释放血红蛋白的过程中起作用的是______________。（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是__________。如果红色区带____________，说明色谱柱制作成功。【答案】（1）血红蛋白的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小（2）杂蛋白(血浆蛋白)血浆蛋白白细胞和淋巴细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯（3）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致均匀一致地移动【解析】（1）血红蛋的提取与分离的实验步骤主要有①样品处理：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析；②粗分离；③纯化：凝胶色谱柱的制作→凝胶色谱柱的装填→样品的加入和洗脱；④
纯度鉴定——聚丙烯酰胺胶电泳。所以A表示血红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱。凝胶色谱法的原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。所以凝胶色谱法是根据相对分子质量大小而达到蛋白质分离的有效方法。（2）洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，释放血红蛋白的过程是让红细胞吸水胀破。如果分层不明显，可能是洗涤次数少，无法除去血浆蛋白。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。甲苯是表面活性剂的一种，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，释放血红蛋白的过程中起作用的是蒸馏水和甲苯。（3）磷酸缓冲液（pH为7.0)能够准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀一致地移动，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。1．下列关于蛋白质性质的叙述中，不会影响到蛋白质在凝胶电泳中运动速度的是A．蛋白质分子的大小B．蛋白质分子的密度C．蛋白质分子的形状D．蛋白质分子所带电荷量2．在蛋白质的提取和分离中，对于样品的处理过程的分析正确的是A．洗涤时离心速度过高、时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果B．洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐C．洗涤过程中用0.1%的生理盐水D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较大的杂质3．下列关于从细胞中提取分离血红蛋白的说法，错误的是A．对样品的处理过程分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析B．洗涤血红蛋白的目的是去除一些杂蛋白，所用试剂为生理盐水C．凝胶色谱法分离血红蛋白时相对分子质量大的蛋白质通过色谱柱的速度快D．将样品加入色谱柱顶端时，下端的流出口应处于打开状态4．下列关于血红蛋白的提取和分离的叙述中，错误的是A．红细胞的洗涤效果与洗涤次数、离心速度和离心时间有关B．凝胶柱中适量气泡的存在会提高分离的效果C．凝胶色谱法是一种根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的方法D．判断纯化的蛋白质是否达到要求可以采用电泳法
5．下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷电性相同的电极方向移动6．相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶色谱柱中的行进过程，可表示为图中哪一个A．B．C．D．7．下列有关血红蛋白的提取与分离的实验操作的叙述，正确的是A．分离红细胞时采用低速长时间离心
B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水即可
C．分离血红蛋白溶液要低速短时间离心D．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h8．镰刀型细胞贫血症是一种由基因突变引起的遗传病，患者的红细胞是弯曲的镰刀状。这样的红细胞容易破裂，使人患溶血性贫血，严重时会导致死亡。某科学兴趣小组计划从血红蛋白的成分是否变化来开展研究性学习。下列是该小组成员获得纯度很高的血红蛋白的实验过程，不正确的一项是A．对红细胞进行洗涤，在加入蒸馏水和甲苯使红细胞破裂释放出血红蛋白后，将混合液静置一段时间后分层获得血红蛋白溶液B．将血红蛋白溶液装入透析袋中透析，可达到粗分离的目的C．利用凝胶色谱操作对血红蛋白进行纯化D．使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定，以获得纯度很高的血红蛋白9．2019年1月10日，施一公教授研究团队在《科学》上报道了人源γ-分泌酶结合淀粉样前体蛋白（APP）的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了结合底物后γ-分泌酶发生的构象变化，并对这些构象变化的功能进行了生化研究，从而为研究与癌症以及阿尔兹海默症相关的特异性药物设计提供了重要的结构信息。回答下列问题：（1）该项研究进行时，需控制温度、酸碱度等条件，因为高温、过酸、过碱会使γ-分泌酶的___________遭到破坏，失去活性。
（2）根据蛋白质的各种特性，如蛋白质分子的____________、所带电荷的___________、以及溶解度、吸附性、对其他分子亲和力等，可用来分离不同种类蛋白质，从而得到γ-分泌酶。（3）γ-分泌酶由4个跨膜蛋白亚基组成，分别为PS1、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。若对γ-分泌酶4个跨膜蛋白亚基进行分离、纯化及分子量测定，需采用_____________及电泳技术。前者是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量较__________（填“大”或“小”）的跨膜蛋白移动速度较慢。（4）电泳是指_____________在电场的作用下发生迁移的过程。对γ-分泌酶的4个跨膜蛋白亚基进行分子量测定时，通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，该方法测定的结果只是_____________的分子量。该电泳迁移率完全取决于相对分子量的大小，原因是______________________。10．红细胞内含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：（1）血红蛋白的提取和分离一般可分为四步：________、粗分离、纯化和________。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行处理、离心后，收集血红蛋白溶液。以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、____________________、____________________。（3）收集的血红蛋白溶液要进行粗分离，其方法是________。然后通过________将样品进一步纯化，最后经________进行纯度鉴定。（4）如图是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入和洗脱示意图。请据图回答下列问题。①在加样品示意图中，正确的顺序是___________________。②用吸管加样品时，应注意正确操作，分别是______________、______________、________________。③待________________时，才加入缓冲溶液。④待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________mL收集一管，连续收集。
1．【答案】B【解析】凝胶电泳法的原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。蛋白质在凝胶电泳中运动速度受到蛋白质的带电性质、电量、形状和大小的影响，与蛋白质分子的密度无关，故B正确。2．【答案】A【解析】A、洗涤红细胞时，采用低速短时间离心法，否则达不到离心的效果，A正确；B、洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，B错误；C、洗涤过程中要用0.9%的生理盐水，C错误；D、透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质，D错误。3．【答案】D【解析】血红蛋白的提取实验中，对样品的处理过程分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析，A正确；洗涤血红蛋白的目的是去除一些杂蛋白，所用试剂为生理盐水，B正确；凝胶色谱法分离血红蛋白时相对分子质量大的蛋白质通过色谱柱的速度快，因为分子质量较小的蛋白质会进入凝胶颗粒内，因此，路径较长，运行速度慢，而分子质量较大的蛋白质则通过的路径短，运行速度快，故C正确；将样品加入色谱柱顶端时，下端的流出口应处于关闭状态，加样完之后才打开下端出口，是样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，然后再加入磷酸缓冲液进行洗脱，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集，故D错误。4．【答案】B【解析】红细胞的洗涤效果与洗涤次数、离心速度和离心时间有关，A正确；凝胶柱中适量气泡的存在会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，B错误；根据上述分析可知，凝胶色谱法是一种根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的方法，C正确；判断纯化的蛋白质是否达到要求可以采用电泳法，D正确。5．【答案】D【解析】蛋白质是生物大分子，不能通过半透膜，而其他小分子可以通过半透膜，可以利用半透膜进行分离得到蛋白质，AB正确。分子大小、密度不同的蛋白质其离心速率不同，通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离，C正确。蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷电性相反的电极方向移动，D错。6．【答案】B
【解析】相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，B正确。7．【答案】D【解析】分离红细胞应采用低速短时间离心，防止白细胞与红细胞一同沉淀，A错误；红细胞释放血红蛋白，需加入蒸馏水和40%体积的甲苯，再在磁力搅拌器上充分搅拌10min，B错误；分离血红蛋白要高速长时间离心，C错误；透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h，D正确。8．【答案】A【解析】对样品进行处理时，应先通过低速短时间离心的方法对红细胞进行洗涤，再加入蒸馏水和甲苯使红细胞破裂释放出血红蛋白后，将混合液置于离心管中，以2000r/min的转速离心10min后分层获得血红蛋白溶液，A项错误；将血红蛋白溶液装入透析袋中，再将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h，可达到粗分离的目的，B项正确；可利用凝胶色谱操作对血红蛋白进行纯化，C项正确；使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定，以获得纯度很高的血红蛋白，D项正确。9．【答案】（1）空间结构（2）形状和大小性质和多少（3）凝胶色谱小（4）带电粒子单条肽链SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别【解析】（1）酶需要适宜的温度和pH，高温、过酸、过碱会使γ-分泌酶的空间结构遭到破坏，失去活性。（2）根据蛋白质的形状和大小、所带电荷的性质和多少、以及溶解度、吸附性、对其他分子亲和力等，可用来分离不同种类蛋白质，从而得到γ-分泌酶。（3）可以用凝胶色谱法和电泳技术对γ-分泌酶4个跨膜蛋白亚基进行分离、纯化及分子量测定。凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量大的蛋白质无法进行凝胶内部的通道，只能在凝胶外移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量小的蛋白质进入凝胶内部，经过的路程较长，移动速度较慢。（4）电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。对γ-分泌酶的4个跨膜蛋白亚基进行分子量测定时，通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会分解成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，故该电泳迁移率完全取决于相对分子量的大小。10．【答案】（1）样品处理纯度鉴定
（2）血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液（3）透析凝胶色谱法SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（4）①④→①→②→③②不能破坏凝胶面贴着管壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动③样品完全进入凝胶层③红色的蛋白质5【解析】（1）血红蛋白的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。（2）样品处理包括红细胞洗涤、血红蛋白释放、分离血红蛋白溶液和透析四步。（3）收集的血红蛋白溶液要通过透析的方法进行粗分离；样品的纯化是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，最后经SDS—聚丙烯酰氨凝胶电泳进行纯度鉴定。（4）①加样和洗脱的具体过程为:调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质，因此正确的加样顺序是④→①→②→③。②用吸管加样时，应注意的正确操作，分别是：使吸管管口沿管壁环绕移动；贴着管壁加样；不要破坏凝胶面。③待样品完全进入凝胶层时，才加入缓冲溶液。④待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
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