第1讲 基因工程1．(2020·山东省淄博市高三三模)土壤农杆菌是一种植物病原菌，它通过根部伤口侵入植物体，刺激植物在被侵入部位形成根瘤，引发根癌。根癌土壤农杆菌质粒的结构如下图所示。请回答：(1)质粒存在于许多细菌细胞中，是拟核外能够自我复制的小型环状DNA，在基因工程中常用作运载体。(2)根癌土壤农杆菌侵染根细胞后，质粒上的T－DNA能转移并整合到根细胞基因组中。被侵染的根细胞增殖形成根瘤，原理是细胞分裂素基因、生长素基因在植物根细胞内表达，合成的细胞分裂素和生长素促进根细胞分裂和生长形成根瘤。(3)冠瘿碱中含有丰富的碳源和氮源，研究表明，根细胞及大部分微生物不能利用冠瘿碱，因此，在根瘤细胞中冠瘿碱的作用是为根癌土壤农杆菌提供营养物质。(4)基因工程中所用的农杆菌质粒需要改造，为不破坏转基因植物的激素平衡，同时又能运载更大的目的基因，改造时应删除农杆菌质粒上的生长素基因、细胞分裂素基因(也可以多答上冠瘿碱合成基因)。[解析] (1)质粒存在于许多细菌细胞中，是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子，在基因工程中常用作运载体。(2)根癌土壤农杆菌侵染根细胞后，质粒上的T－DNA可转移并整合到根细胞基因组中。由图示可知，根癌土壤农杆菌质粒上的T－DNA中含有细胞分裂素基因和生长素基因，当根癌土壤农杆菌侵染根细胞后，细胞分裂素基因、生长素基因在植物根细胞内表达，合成的细胞分裂素和生长素促进根细胞分裂和生长，因此能够形成根瘤。(3)冠瘿碱中含有丰富的碳源和氮源，根细胞及大部分微生物不能利用冠瘿碱，因此，在根瘤细胞中冠瘿碱的作用是为根癌土壤农杆菌提供营养物质，有利于其生长和发挥侵染作用。(4)基因工程中所用的农杆菌质粒需要改造，由于受体植物本身含有生长素基因和细胞分裂素基因，为不破坏转基因植物的激素平衡，同时又能运载更大的目的基因，改造时应删除农杆菌质粒上的生长素基因、细胞分裂素基因，冠瘿碱合成基因也可删除。2．(2021·山东省威海市文登区高三上学期期末)真核生物基因中通常有内含子，动物和植物具有的切除内含子对应的RNA序列的机制不同。科学家将某种鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，欲培育出耐寒的番茄新品种。回答下列问题：6
(1)获取抗冻蛋白基因时，需要使用限制酶，这种限制酶的专一性表现为能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。将抗冻蛋白基因导入受体细胞之前要构建基因表达载体，该操作的目的是使目的基因在受体细胞中复制、稳定存在并且可以遗传给下一代，该步骤中常用两种能产生不同黏性末端的限制酶对运载体进行切割，这样做的优点可以防止质粒(运载体)自身环化。(2)科学家构建了这种鱼的基因组文库和cDNA文库，两种文库中都含有鱼的抗冻蛋白基因。若要培育耐寒的番茄，应从这种鱼的cDNA文库(“基因组文库”或“cDNA文库”)中筛选目的基因，不从另一种文库中筛选的原因是从基因组文库获取的目的基因含有内含子，动物和植物具有的切除内含子对应的RNA序列的机制不同，导致目的基因在受体细胞中无法正常表达。(3)培育出转基因番茄植株后，需要使用放射性标记的核酸做探针进行检测，可检测的内容有转基因生物的DNA上是否插入了目的基因、目的基因是否转录mRNA(答出两点)，其原理是探针序列可特异性地与目的基因及其转录的RNA序列碱基互补配对。[解析] (1)限制酶的专一性表现为能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中复制、稳定存在并且可以遗传给下一代。该步骤中常用两种能产生不同黏性末端的限制酶对运载体进行切割，这样可以防止质粒(运载体)自身环化。(2)从基因组文库获取的目的基因含有内含子，动物和植物具有的切除内含子对应的RNA序列的机制不同，导致目的基因在受体细胞中无法正常表达，故若要培育耐寒的番茄，应从这种鱼的cDNA文库中获取。(3)培育出转基因番茄植株后，需要使用放射性标记的核酸做探针检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因、目的基因是否转录mRNA，其原理是探针序列可特异性地与目的基因及其转录的RNA序列碱基互补配对。3．(2020·广东高考模拟)回答下列基因工程的相关问题：(1)基因工程中，阐明遗传信息流动方向的基础理论是中心法则；自然界中的原核生物容易受到外源DNA的入侵，但依然可以达到保护自身的目的，这为人们寻找限制性核酸内切酶(答基因工程的工具)提供了启示。质粒作为基因工程的载体，应具备的基本条件：能够自我复制、具有标记基因和一个至多个酶切位点。(2)动物和植物中内含子的剪接系统不同，如果要将一个来自动物且含有内含子的目的基因转入植物中进行表达，只能用该基因的cDNA(mRNA反转录产生的互补DNA)。利用乳腺生物反应器批量生产药物时，需要将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，才能最终实现目的基因的表达。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。(4)用目的基因的片段作为探针，在基因工程中可以检测6
目的基因是否插入到染色体DNA中，目的基因是否转录出mRNA。[解析] (1)细胞内，遗传信息流动方向概括为中心法则，所以基因工程也是以中心法则阐明遗传信息的流动方向为理论基础的。细胞内能破坏外来DNA和自身损伤的DNA的物质是限制酶，原核生物也不例外。所以在自然界中的原核生物的细胞内存在限制酶。质粒作为基因工程的载体，应具备的基本条件：能够自我复制、具有标记基因和一个至多个酶切位点。(2)由于动物和植物中内含子的剪接系统不同，所以希望跨物种转入的基因能得到表达，只能用该基因转录产生的mRNA作为模板，通过反转录得到的cDNA片段。利用乳腺生物反应器批量生产药物时，希望动物乳腺细胞内合成的药物能随乳汁分泌，需要将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，才能最终实现目的基因的表达并分泌。(3)由于噬菌体没有细胞结构，所以基因工程中用某些噬菌体作载体，其DNA复制所需的原料、能量和酶等都来自于受体细胞。(4)用目的基因的片段作为探针，在基因工程中可以检测目的基因是否插入到染色体DNA中以及目的基因是否转录出mRNA，其原理都是利用核酸分子杂交技术。4．(2020·四川高考模拟)如图是从酵母菌中获取某种酶基因的流程示意图。回答下列问题：(1)从图示流程可知，目的基因可以从基因文库中获取。(2)图中基因组文库大于(填“大于”“等于”或“小于”)cDNA文库。B过程所需的酶是逆转录酶。(3)将该目的基因导入植物细胞，通常采用的方法是农杆菌转化法；导入微生物细胞，通常采用Ca2＋处理细胞，使之转化为感受态细胞。(4)检测目的基因是否翻译出蛋白质可采用抗原－抗体杂交技术。导入细菌受体细胞中的目的基因成功表达的标志是细菌细胞中提取到相应蛋白质。[解析] (1)由图可知，目的基因可以从基因文库(基因组文库或cDNA文库)中获取。(2)基因组文库包括了该种生物所有的基因，而部分基因文库只包含一种生物的部分基因，因此基因组文库大于cDNA文库。B表示逆转录过程，需要逆转录酶。(3)将该目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞转化法，即用Ca2＋处理细胞，使之转化为感受态细胞。(4)检测目的基因是否翻译出蛋白质可用抗原－抗体杂交技术，导入细菌受体细胞中的目的基因成功表达的标志是细菌细胞中提取到相应蛋白质。5．(2020·陕西高考模拟)研究人员发现，从锥形蜗牛体内提取出的毒液有望帮助人类开发出超级速效的胰岛素。他们研究表明锥形蜗牛毒蛋白(Con－Ins6
GI)能加速受体细胞信号转换，比人类胰岛素更加快速的发挥作用。因此制造这类“速效胰岛素”以及利用转基因技术实现批量生产成为I型糖尿病治疗的新思路。请回答下列问题：(1)利用基因工程制造这种速效胰岛素过程中，构建基因表达的载体一般包括目的基因、启动子、标记基因、终止子和复制原点，标记基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的细胞。(2)为了获得目的基因可以通过提取分析毒蛋白中的氨基酸序列推知毒蛋白基因的核苷酸序列，再用DNA合成仪直接大量合成。基因工程中需要DNA连接酶，根据酶的来源不同分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类。(3)将人工合成的目的基因导入大肠杆菌体内，一般先用药物处理大肠杆菌使之成为感受态细胞，再将重组DNA溶于缓冲液中与该类细胞融合，在一定温度下促进细胞吸收重组DNA分子完成转化过程。(4)经过目的基因的检测和表达，获得的Con－InsGI毒蛋白活性未能达到期待的“速效胰岛素”的生物活性，导致这种差异的原因可能是大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未加工。[解析] (1)构建的表达载体含有目的基因(速效胰岛素基因)、标记基因、启动子及终止子等，其中启动子、终止子也是一段DNA分子，标记基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的细胞。(2)目的基因的获取可采用的方法有：原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。为了获得目的基因可以通过提取分析Con－InsGl毒蛋白中的氨基酸序列推知毒蛋白基因的核苷酸序列，再用DNA合成仪直接大量合成。基因工程中需要DNA连接酶，根据酶的来源不同分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类。(3)将人工合成的目的基因导入大肠杆菌体内，一般先用药物处理大肠杆菌使之成为感受态细胞，再将重组DNA溶于缓冲液中与该类细胞融合，在一定温度下促进细胞吸收重组DNA分子完成转化过程。(4)经过目的基因的检测和表达，获得的Con－InsGl毒蛋白活性未能达到期待的“速效胰岛素”的生物活性，导致这种差异的原因可能是大肠杆菌属于原核生物，其细胞中不含内质网和高尔基体，基因表达获得的蛋白质未加工。6．(2021·芜湖市高三期末理综)国际水稻研究所人员从产量低的耐淹水稻中找到一种耐淹基因，将其移入到高产热带水稻中，终于培育出耐淹的高产水稻品系，其产量比高产热带水稻产量还要高。耐淹基因移入的方法可通过转基因技术实现。请回答下列相关问题：(1)为培育耐淹的高产水稻品系，应需将耐淹基因进行体外扩增。在PCR反应体系中加入了热稳定DNA聚合酶、引物等，还加入耐淹基因作为模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)作为合成DNA的原料。(2)质粒常被用作运载体，因为质粒具有能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，便于目的基因插入；具有标记基因，便于检测和筛选(答2点即可)。构建耐淹基因的质粒表达载体时，常用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，目的是减少耐淹基因及质粒的自身环化、增大耐淹基因正向(正确)连接的概率。6
(3)根据耐淹基因表达的蛋白质，研究人员通过对它的氨基酸序列设计并人工合成耐淹基因。与水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在结构上缺少了启动子、终止子和内含子。虽然两种基因转录的产物不同，但最终表达出相同的蛋白质，可能的原因是密码子具有简并性。(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质的原因是改造基因易于操作且改造后能够遗传。[解析] (1)利用PCR技术在体外扩增耐淹基因(目的基因)时，在PCR反应体系中除了加入热稳定DNA聚合酶、引物等外，还加入耐淹基因作为模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)作为合成DNA的原料。(2)质粒被用作运载体，应具备的条件有：能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，便于目的基因插入；具有标记基因，便于检测和筛选。构建耐淹基因的质粒表达载体时，用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，可以减少耐淹基因及质粒的自身环化、使耐淹基因定向连接到质粒上，以增大耐淹基因正向(正确)连接的概率。(3)与水稻的耐淹基因相比，根据耐淹基因表达的蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA分子中，缺乏与基因中的启动子、终止子和内含子相对应的碱基序列，据此设计并人工合成的耐淹基因在结构上缺少了启动子、终止子和内含子。由于密码子具有简并性，虽然两种基因转录的产物不同，但最终能够表达出相同的蛋白质。(4)由于直接改造的蛋白质不能遗传，而改造基因易于操作且改造后能够遗传，所以在蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质。7．(2020·陕西高考模拟)通过基因工程利用小球藻生产人胰岛素能克服利用细菌生产时的诸多不利影响。小球藻可大规模种植，并且所生产的胰岛素可以直接用于医疗和保健，该技术能提高小球藻的药用价值，形成高附加值的生物技术产品，同时也能降低医用蛋白的价格，使人胰岛素的应用得到普及。回答下列问题：(1)基因工程中的目的基因可以从自然界中原有的物种中获得，也可以利用人工化学合成的方法获得目的基因。将目的基因导入植物细胞的最常用方法是农杆菌转化法。(2)在生物体外常用PCR技术来扩增目的基因。在PCR体系中需要加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)，dNTP脱去两个磷酸后形成的物质能作为DNA合成的原料，则dATP和ATP在组成成分上的差别是构成dATP的五碳糖是脱氧核糖，构成ATP的五碳糖是核糖。在PCR体系中不需要(填“需要”或“不需要”)加入ATP。(3)某PCR体系中用到的引物序列是GGCCATT和CCGGTAA，这两种引物设计是否合理？不合理(填“合理”或“不合理”)，理由是两种引物之间能够发生碱基互补配对，会降低引物的使用效率。(4)利用小球藻合成的人胰岛素和利用细菌合成的人胰岛素在空间结构上存在较大差异，其原因是小球藻是真核生物，其细胞中的内质网和高尔基体能对人胰岛素进行加工，而细菌则不能。6
[解析] (1)基因工程所需的目的基因除可以从自然界中原有的物种中获得外，还可以利用人工化学合成的方法获得目的基因。将目的基因导入植物细胞的最常用方法是农杆菌转化法。(2)在生物体外常用PCR技术来扩增目的基因。在PCR体系中需要加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)，dNTP脱去两个磷酸后形成的物质能作为DNA合成的原料，则dATP的含义是脱氧三磷酸腺苷，而ATP的含义是三磷酸腺苷，二者在化学组成成分上的差别是前者所含的五碳糖是脱氧核糖，后者所含的五碳糖是核糖。由于每种原料中都含有高能磷酸键，所以在PCR体系中不需要再加入ATP分解供能了。(3)如果在PCR体系中加入的两种引物序列是GGCCATT和CCGGTAA，二者之间刚好能够发生碱基互补配对，这样会降低引物的使用效率，所以用这样两种序列作为引物是不合理的。(4)小球藻是真核生物，细胞内有内质网、高尔基体等加工分泌蛋白的细胞器，而细菌是原核生物，细胞没有具有膜结构的细胞器，所以利用小球藻合成的人胰岛素和利用细菌合成的人胰岛素在空间结构上存在较大差异。8．(2021·六盘水市第七中学高三月考)科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示：(1)基因工程的操作程序中的核心步骤是：基因表达载体的构建，需要的工具酶有限制性核酸内切酶(限制酶)和DNA连接酶。(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，能把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用了T－DNA可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体的DNA上的特点。(3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞中并成功实现表达的过程，在基因工程中称为转化。(4)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是农杆菌转化法。(5)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是DNA分子杂交。[解析] (1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤；工具酶包括限制酶和DNA连接酶。(2)农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA具有可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上的特点，因此可以用来导入目的基因。(3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现了表达的过程，在基因工程中称为转化。(4)本题中将目的基因导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。(5)目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上是目的基因能否在棉株体内稳定遗传的关键，可通过DNA分子杂交技术进行检测。6
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