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1.1 DNA重组技术的基本工具
1．科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
解析：基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就是定向地改造了生物的遗传性状。
答案：D
2．下列关于限制酶的说法，正确的是( )
A．限制酶广泛存在于各种生物中，其化学本质是蛋白质
B．一种限制酶只能识别一种或一类特定的核苷酸序列
C．不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端
D．限制酶均能特异性地识别由6个核苷酸组成的序列
解析：限制酶主要存在于微生物中，A错误；限制酶具有专一性，即一种限制酶只能识别一种或一类特定的核苷酸序列，B正确；不同的限制酶切割DNA后会形成黏性末端或平末端，C错误；限制酶均能特异性地识别核苷酸序列，但识别的核苷酸序列不一定是由6个核苷酸组成的，D错误。
答案：B
3．下列关于DNA连接酶的作用的叙述，正确的是( )
A．将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接两条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来
解析：选项A是DNA聚合酶的作用，故A项错误。DNA连接酶能将双链DNA片段末端连接起来，重新形成磷酸二酯键，故B项正确、C项错误。D项只涉及了E·coli DNA连接酶的作用T4 DNA连接酶还可以连接平末端，故D项错误。
答案：B
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4．如下图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步骤需用到的工具酶是( )
A．DNA连接酶和解旋酶
B．DNA聚合酶和限制性核酸内切酶
C．限制性核酸内切酶和DNA连接酶
D．DNA聚合酶和RNA聚合酶
解析：目的基因和载体结合需“分子手术刀”——限制性核酸内切酶和“分子缝合剂”——DNA连接酶。此过程不涉及DNA复制，不需要DNA聚合酶和解旋酶。
答案：C
5．下图为DNA分子的切割和连接过程。
DNA分子的切割和连接
(1)EcoR I是一种______________酶，其识别序列是__________，切割位点是_____________与________________之间的__________键。切割结果产生的DNA片段末端形式为__________。
(2)不同来源的DNA片段结合，在这里需要的酶应是_________，此酶的作用是在________________与________________之间形成______键而起“缝合”作用的，其中能连接平末端的连接酶是_____。
解析：EcoR I是一种限制酶，从图中可以看出其识别序列是GAATTC，切割位点是鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。切割后产生的DNA末端形式为黏性末端。要将不同来源的DNA片段连接起来，需要DNA连接酶，其作用是形成磷酸二酯键而将两DNA片段“缝合”起来。T4 DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端，也可以“缝合”平末端。
答案：
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(1)限制性核酸内切(限制) GAATTC 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 磷酸二酯 黏性末端
(2)E·coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 磷酸二酯 T4 DNA连接酶
A级 基础巩固
1．能有效地打破物种的界限，定向地改造生物的遗传性状，培育新的农作物优良品种的生物技术是( )
A．基因工程技术 B．诱变育种技术
C．杂交育种技术 D．组织培养技术
解析：诱变育种是在一定的条件下，对某一品种进行诱变而产生的突变性状；杂交育种必须在同种生物之间进行；组织培养技术是无性生殖，难以产生新品种；而基因工程可以打破物种的界限，在不同种生物之间进行基因重组，从而定向改造生物的遗传性状。
答案：A
2．在基因工程中，常用的“剪刀”“针线”和“载体”分别指( )
A．大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶
B．噬菌体、质粒、DNA连接酶
C．限制酶、RNA连接酶、质粒
D．限制酶、DNA连接酶、质粒
解析：基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由此可见，DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶(限制酶)—分子“剪刀”，DNA连接酶—分子“针线”，质粒、动植物病毒或噬菌体—运载体。
答案：D
3．下列四个DNA分子，彼此间具有黏性末端的一组是( )
A．①② B．②③
C．③④ D．②④
解析：两个黏性末端彼此之间可以根据碱基互补配对原则连接成DNA片段。
答案：D
4．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( )
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A．能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
D．能够在受体细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选
解析：作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达，必须能够在受体细胞内稳定地保存并大量复制。同时要具有某些标记基因，是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞，从而筛选受体细胞。载体要具有多个限制酶切割位点，则是为了便于与外源基因连接。
答案：A
5．限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列，下图为四种限制酶BamHⅠ，EcoR Ⅰ，Hind Ⅲ和Bgl Ⅱ的识别序列和切割位点：
切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是( )
A．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ B．BamH Ⅰ和Hind Ⅲ
C．BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ D．EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ
解析：BamHⅠ切割出来的DNA黏性末端是—GATC—，BglⅡ切割出来的DNA黏性末端也是—GATC—，它们可以互补配对。
答案：C
B级 能力训练
6．如图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列，并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图，请回答以下问题：
(1)图中甲和乙代表_____________________________________。
(2)EcoRⅠ、HpaⅠ代表_________________________________。
(3)图中甲和乙经过相应操作均形成两个片段，切口的类型分别为________________、________________。甲中限制酶的切点是________________之间，
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乙中限制酶的切点是________________之间。
(4)由图解可以看出，限制酶的作用特点是__________________
______________________________________________________。
(5)如果甲中G碱基发生基因突变，可能发生的情况是________
_____________________________________________________。
解析：(1)由题图看出，甲和乙代表由脱氧核苷酸构成的不同的DNA片段。(2)EcoRⅠ和HpaⅠ能切割DNA分子，说明它们是限制酶。(3)甲中切点在G、A之间，切口在识别序列中轴线两侧，形成黏性末端；乙中切点在A、T之间，切口在识别序列中轴线处，形成平末端。(4)限制酶能识别DNA分子的特定核苷酸序列，并从特定位点切割DNA分子。(5)当特定核苷酸序列变化后，就不能被相应限制酶识别。
答案：(1)有特定脱氧核苷酸序列的DNA片段
(2)两种不同的限制酶
(3)黏性末端 平末端 G、A A、T
(4)能识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并从特定的位点将DNA分子切开
(5)限制酶不能识别切割位点
7．限制酶MunⅠ和限制酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是—C↓TTAAG—和—G↓AATTC—。如下图表示的是四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
解析：目的基因两侧有MunⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶的识别序列，用这两种酶切割都可得到目的基因；B中质粒无标记基因，不符合作为载体的条件；C、D中的标记基因都会被破坏。
答案：A
8．下图表示某种质粒和人的胰岛素基因，其中a表示标记基因，b表示胰岛素基因，E1表示某限制酶的酶切位点，现用该种限制酶分别切割质粒和胰岛素基因，后用DNA连接酶连接切割后的质粒和胰岛素基因，下列选项中不可能出现的是( )
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解析：根据目的基因和质粒上的限制性核酸内切酶的切割位点及相互连接情况判断不可能出现选项C的连接。
答案：C
9．据图所示，有关工具酶功能的叙述错误的是( )
A．限制酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开
D．DNA连接酶可以连接c处
解析：限制酶切割DNA分子时破坏的是DNA链中的磷酸二酯键，如图a处。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键，因此DNA聚合酶可以连接a处。解旋酶解开两个碱基对之间的氢键，即b处解开。DNA连接酶连接的是两个相邻的脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，如a处，而图示的c处连接的是同一个脱氧核苷酸内的磷酸和脱氧核糖。
答案：D
10．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图判断下列操作正确的是( )
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
解析：解此题要明确目的基因要切下，质粒只要切开。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—
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↓GATC—，单独使用时可以把目的基因和质粒都切断；限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，只能把它们切开，单独使用时不能切下，所以目的基因用限制酶Ⅱ切割，质粒用限制酶Ⅰ切割；因为用限制酶Ⅰ切割质粒时破坏了GeneⅡ，所以只能用Gene Ⅰ作为标记基因。
答案：D
11．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
该酶识别的序列为__________________，切割的部位是________________。
(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是
______________________________________________________。
(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。
(5)基因工程中除质粒外，______________和____________也可作为载体。
解析：(1)限制酶切割DNA分子后可产生两种类型的末端，即平末端和黏性末端。(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—，互补链是—CTTAAG—，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶切割，说明该酶与限制酶X切割产生的黏性末端相同。(4)基因工程使用的DNA连接酶，按来源可分为E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E·coli DNA连接酶。(5)基因工程的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。
答案：(1)黏性末端 平末端
(2)—GAATTC—或—CTTAAG— G和A之间的磷酸二酯键
(3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同
(4)T4 E·coli
(5)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
12．如图为某基因工程中利用的质粒简图，小箭头所指分别为限制酶EcoR I、BamH I的酶切位点，ampR为青霉素(抗生素)抗性基因，tetR为四环素(抗生素)抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR I、BamH I在内的多种酶的酶切位点。
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据图回答下列问题：
(1)在基因工程中常用的工具有三种：一是用于切割DNA分子的________；二是将目的基因与载体拼接的________；三是作为载体的质粒。
(2)将含有目的基因的DNA与经特定的酶切后的载体(质粒)进行拼接形成重组DNA，理论上讲，重组DNA可能有“________________”“________________”“____________________”三种，其中有效的(所需要的)重组DNA是________________。因此需要对这些拼接产物进行分离提纯。
(3)利用图示的质粒拼接形成的三种拼接产物(重组DNA)与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的拼接产物(重组DNA)是_____________________。
解析：(1)在基因工程中常用的工具酶有两种：一是用于切割DNA分子的限制酶，二是将目的基因与载体连接的DNA连接酶。(2)用同一种限制酶将含有目的基因的DNA和质粒分别切开，产生的黏性末端相同，进行拼接形成的重组DNA，理论上讲，可能有目的基因—目的基因、目的基因—载体和载体—载体三种。其中人们所需要的重组DNA是目的基因—载体。(3)由图可以看出两种限制酶的酶切位点都在四环素抗性基因中，两种限制酶都能破坏四环素抗性基因，因此用该质粒拼接形成的三种拼接产物(重组DNA)与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的拼接产物应是载体—载体(仍有抗性基因)。
答案：(1)限制酶(限制性核酸内切酶) DNA连接酶
(2)目的基因—目的基因 目的基因—载体 载体—载体 目的基因—载体 (3)载体—载体
13．如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。
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(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是__________，二者还具有其他共同点：如①_____________，②_____________(写出两条即可)。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为____________；可使用____________把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________________，
其作用是______________________________________________
______________________________________________________。
(4)下列常在基因工程中用作载体的是( )
A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因
B．土壤农杆菌中的RNA分子
C．大肠杆菌的质粒
D．动物细胞的染色体
答案：(1)DNA 能够自我复制 具有遗传效应
(2) DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA的鉴定和选择
(4)C
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