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多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、选择题
1．关于PCR的说法，错误的是( )
A．PCR是体外复制DNA的技术
B．PCR过程中只需要一个模板DNA、两个引物分子、大量脱氧核苷酸原料
C．Taq DNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶
D．PCR利用的是DNA双链复制原理
解析：选B PCR技术是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术；PCR过程除需要DNA分子双链作为模板、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料外，还需要酶等条件；Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶；PCR技术的原理和DNA的复制原理是一样的，都是半保留复制。
2．关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法，正确的是( )
A．Taq DNA聚合酶是从深海生态系统中发现的
B．DNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列
C．Taq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加
D．DNA聚合酶是以DNA为模板，使DNA子链从5′端延伸到3′端的一种酶
解析：选D Taq DNA聚合酶是在热泉中发现的。PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列。Taq DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用而不用另外再添加。DNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，而只能从DNA单链的3′端延伸子链。
3．多聚酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温复性及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术的叙述错误的是( )
A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．应用PCR技术与DNA分子杂交技术可以检测基因突变
解析：选C PCR技术是体外大量扩增DNA的技术，即以少量DNA制备大量DNA的技术；PCR技术的原理是DNA复制，反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，所需原料是脱氧核苷酸，以指数方式扩增；应用PCR技术与DNA分子杂交技术可以检测基因突变。
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4．PCR一般要经过三十多次循环，从第二次循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将( )
A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D．无须与引物结合，在酶的作用下从头合成子链
解析：选B 当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA的子链。
5．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是( )
①循环次数不够 ②Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制 ③引物不能与亲链结合 ④系统设计欠妥
A．①②③ B．①②④
C．①③④ D．②③④
解析：选B ①循环次数过少，产物的量比预期的少；②Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制会导致扩增效率低，得到的产物比预期的少；③如果引物设计不合理，则无法进行扩增；④PCR系统设置不妥，将达不到预期的效果。
6．下列关于PCR技术的叙述，正确的是( )
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术应用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、酶等条件
解析：选D PCR技术不必知道目的基因的全部序列，只需知道部分序列，就可根据已知序列合成引物。PCR技术不需要解旋酶。PCR技术需要引物，但引物的序列不能是互补的，否则，在复性时，两种引物通过碱基互补配对结合而失去作用。
7．下列有关PCR的叙述，正确的是( )
A．PCR所需要的引物只能是RNA
B．PCR所需要的原料是核糖核苷酸
C．PCR所需要的酶在60 ℃会变性
D．PCR需要在一定的缓冲液中进行
解析：选D PCR所需的引物是一小段DNA或RNA。PCR所需要的原料是脱氧核苷酸。PCR所需要的酶是耐高温的Taq DNA聚合酶。
8．在PCR的实验操作中，下列说法正确的是( )
①在微量离心管中添加各种试剂时，只需要一个枪头
②离心管的盖子一定要盖严
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③用手指轻弹离心管壁
④离心的目的是使反应液集中在离心管的底部
A．①②③ B．①②④
C．②③④ D．①③④
解析：选C 在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，以确保实验的准确性；盖严离心管口的盖子，防止实验中外源DNA污染；用手指轻轻弹击离心管的侧壁，使反应液混合均匀；离心的目的是使反应液集中在离心管的底部，提高反应效果。
9．复性温度是影响PCR特异性的较重要的因素。变性后温度快速冷却至40～60 ℃，可使引物与模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括( )
A．由于模板DNA比引物复杂得多
B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
C．加入引物的量足够多而模板链数量少
D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合
解析：选D DNA双链变性解旋后是可以再次结合的，只不过是在PCR中，引物量较多，与DNA模板链结合机会大，而原来两条母链再次结合的机会小。
10．如图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的( )
A．②①③④ B．①③④②
C．①②④③ D．①②③④
解析：选D 因为PCR的反应过程需要引物，在第二轮循环的产物中，a、d的引物分别为Ⅰ、Ⅱ，无引物的为模板链(即①、④)，则b、c的模板链分别为②、③。
二、非选择题
11．PCR技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答：
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(1)A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的叙述，正确的是( )
A．该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B．该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C．该过程不需要解旋酶的作用
D．该过程与人体细胞的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是________________。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以______加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有__________________________________________________。
(3)如果模板DNA分子共有a个碱基对，其中含有胞嘧啶m个，则该DNA复制10次，需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸____________________个。
(4)PCR中由碱基错配引起的变异属于_____________________________________。假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时一条模板链上发生碱基错配，之后正常配对，则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占________________________________________________________________________。
解析：(1)高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。(2)C过程是PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升至72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。Taq DNA聚合酶具有耐高温的特性，所以一次性加入即可。(3)在一个双链DNA分子中，C＋T占碱基总数的一半，则T的数目为(a－m)个，复制10次，新增加了(210－1)个DNA分子，故需补充胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数目为(210－1)(a－m)个。(4)基因中碱基对的改变属于基因突变。以一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，以后按正常配对方式进行扩增，以错配链作为模板扩增的都是错误的DNA分子，原正常链扩增得到的DNA分子都是正常的DNA分子，故若干次后检测所有DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占3/4。
答案：(1)C (2)Taq DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 (3)(210－1)(a－m) (4)基因突变 75%
(或3/4)
12．请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。
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图中引物为单链DNA片段，它是子链合成、延伸的基础。①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为____________。
②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
①第1组：______________________________________________________；
②第2组：________________________________________________________________。
(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为______________________________________________________。
解析：(1)①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。②在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；②引物 Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。
答案：(1)①15/16 ②三
(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物 Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
13．如图为细胞内DNA复制过程示意图，该过程在体外也可进行，以获得大量相同的DNA片段，该项技术被称为PCR技术，又称多聚酶链式反应，请分析回答：
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(1)PCR过程与细胞内DNA复制相比，主要不同点是
________________________________________________________________________。
(2)PCR技术过程的三个步骤是：________、________、________。
(3)假设PCR过程中，只用一个DNA片段作为模板，30次循环后，理论上反应物中有________个这样的DNA片段。
(4)PCR技术能在几小时内将微量的DNA片段特异性地扩增上百万倍，从而解决了样品中DNA含量低，难以分离的难题，试举两例，说明PCR技术的应用：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR过程与细胞内DNA复制相比，主要不同点是：PCR过程是高温变性解旋，不需要解旋酶。(2)PCR的每次循环可以分为变性、复性和延伸三个步骤。(3)由于一个DNA片段作为模板，一次循环能产生2个DNA片段，所以30次循环后，反应物中大约有230个这样的DNA片段。(4)PCR技术有广泛的应用，可以用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、亲子鉴定等方面。
答案：(1)PCR过程是高温变性解旋，不需要解旋酶 (2)变性 复性 延伸 (3)230 (4)刑侦破案、亲子鉴定、疑难疾病的诊断、基因序列分析等
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