专题4 酶的研究与应用
课题4.3 酵母细胞的固定化
一、【课题目标】
（一）知识与技能
1、识记固定化技术的常用方法
2、理解固定化酵母细胞的制备过程
3、知道固定化酶的实例
（二）过程与方法
1、固定化细胞技术
2、制备固定化酵母细胞的过程
（三）情感、态度与价值观
通过固定化技术的发展过程，培养科学探究精神，同时领会研究的科学方法
二、【课题重点】
制备固定化酵母细胞
三、【课题难点】
制备固定化酵母细胞
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用
（二）进行新课
1．基础知识
1．固定化酶的应用实例――生产高果糖浆
（1）高果糖浆的生产原理：
葡萄糖异构酶
果糖
葡萄糖
（2）葡萄糖异构酶固定：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上，装入反应柱中。
（3）高果糖浆的生产操作（识图4－5反应柱）：
从反应柱上端注入葡萄糖溶液，从下端流出果糖溶液，一个反应柱可连续使用半年。
2．固定化技术的方法（识图4－6固定方法）：
将酶和细胞固定化方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法。
【比较】酶和细胞的固定方法和特点
固定对象
酶
细胞
适宜固定法
化学结合法、物理吸附法
包埋法
特 点
5
体积小，固定一种酶。包埋法容易丢失
体积大，固定一系列酶。难以化学结合和吸附
〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法。
〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。
3．固定细胞的材料：
固定细胞时应当选用不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等
2．实验设计
1．制备固定化酵母细胞
（1）酵母细胞的活化：
1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考3〗活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
（2）配制CaCl2溶液：
0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。
（3）配制海藻酸钠溶液：
0.7g海藻酸＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
〖思考4〗微火加热并不断搅拌的目的是什么？防止海藻酸南焦糊。
（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：
将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。
〖思考5〗为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？
防止高温杀死酵母细胞。
（5）固定化酵母细胞：
以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。
2．固定化酵母细胞的发酵
（6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。
（7）发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞→200mL锤形瓶→密封→25℃发酵24h。
〖思考6〗发酵过程中锥形瓶为什么要密封？
酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。
〖思考7〗锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的。
〖思考8〗在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的过程中，需要无菌操作码？
需要。
酵母细胞的活化
配制CaCl2溶液
配制海藻酸钠溶液
将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
固定化酵母细胞
冲洗凝胶珠
酒精发酵
3．发酵操作
5
（三）课堂总结、点评
酵
母
细
胞
固
定
化
酶
固定
化
酶
固定
化
细胞
固定化技术
高果糖浆
生产
酵母固定
材料
方法
活化酵母
配置
溶液
溶液混合
固定化酵母
固定酵母发酵
（四）实例探究
例1关于酵母菌的叙述，正确的是
A．酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖
B．酵母菌的代谢类型是异养厌氧型
C．酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜
D．用酵母菌酿酒时，应先密封后通气
解析：酵母菌在环境适宜时进行出芽生殖，环境不良时进行孢子生殖。代谢类型为异养兼性厌氧型。酵母菌细胞为真核细胞，因此具有生物膜系统。在酿酒时，应当先通气后密封。
答案：C
例2研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，于微生物降解相比，其作用不需要适宜的
A．温度 B．酸碱度 C．水分 D．营养
解析：本题考察酶和细胞的比较，二者的正常活动都需要一定的条件，如温度、酸碱度、水份等，但是酶本身是一种大分子物质，不需要营养，而细胞的生活离不开营养物质。
答案：D
☆综合应用
例3．下列有关固定化技术的叙述，正确的是（ ）
A．固定化酶只是在细胞内才能发挥作用
B．固定化酶能提高酶的利用率
C．酶的固定是酶分离纯化的常用方法
D．固定化酶的固定化方式就是吸附在固体表面上。
解析：制成固定化酶的步骤是：酶的生产、提取、酶的分离纯化、酶的固定化，制成固定化酶的方法有吸附在固体表面，有将酶相互连接起来．将酶包埋在细微的网格里等；这样的固定化酶能重复利用，从而提高了酶的利用率；而酶在条件适宜时，既可在细胞内起作用，也能在细胞外起作用，制成的固定化酶，更是主要在细胞外发挥作用。
答案选B
（五）巩固练习
1．酶的固定化常用的方式不包括
A．吸附 B．包埋 C．连接 D．将酶加工成固体
2．溶解海藻酸钠，最好采用 加热的方法
A．小火间断 B．小火持续 C．大火间断 D．大火持续
3．高果糖浆生产需要的酶是
A．葡萄糖异构酶 B．蔗糖酶 C．麦芽糖酶 D．果糖酶
4．关于酵母菌的叙述，正确的是
A．酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖
B．酵母菌的代谢类型时异养厌氧型
5
C．酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜
D．用酵母菌酿酒时，应先密封后通气
5．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，于微生物降解相比，其作用不需要适宜的
A．温度 B．酸碱度 C．水分 D．营养
6．将酵母菌的培养液由富氧状态变为缺氧状态，下面加快的一项是
A．CO2的释放 B．丙酮酸的氧化 C．葡萄糖的利用 D．ATP的形成
7．固定化酶的优点是
A．有利于增加酶的活性 B．有利于产物的纯化
C．有利于提高反应速度 D．有利于酶发挥作用
8．下列不是用于包埋法固定化细胞的载体是
A．琼脂糖 B．醋酸纤维素 C．聚丙烯酰胺 D．聚乙烯树脂
9．关于固定化细胞的叙述，正确的是
A．催化效率高，低耗能、低污染
B．对环境的条件非常敏感，容易失活
C．既能与反应物充分接触，又能与产物分离
D．成本低、操作简单，但反应效果可能很低
10．固定化细胞技术不包括
A．包埋法 B．化学结合化 C．物理法 D．生物法
答案：
1．D 2．A 3．A 4．B 5．D 6．C 7．B 8．D 9.C 10.D
七、【课余作业】
1．什么是细胞的活化。
2．如何检验凝胶珠的质量是否合格。
八、【教学体会】
固定化酶的技术要求比较高，因此在教学过程中重点介绍固定化酵母细胞的操作。对于固定化酶的作用、原理及其在生产中的应用，主要是让学生通过生产实例来了解。教师在教学时可以采用让学生能够阅读自学的方式。例如，在葡萄糖的异构反应中，如果不将葡萄糖异构酶固定化，而是直接使用葡萄糖异构酶，会对生产产生哪些影响？
九、【资料袋】
固定化细胞的载体
固定化细胞技术所采用载体的物理化学性质直接影响所固定细胞的生物活性和体系传质性能。理想的载体材料应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定。寿命长、价格低廉等特性。它可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类。
有机高分子载体又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体。天然高分子凝胶一般对生物无毒，传质性能较好，但强度较低，在厌氧条件下易被生物分解。有机合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对细胞活性有影响，易造成细胞失活。
无机载体大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应，从而把微生物固定。它的操作方法是把载体放人含有一定微生物浓度的溶液中，固定一段时间（24h左右）即可。
5
由有机载体和无机载体材料组成的复合载体材料，可以改进载体材料的性能。Lin等将粉末活性炭和Phanerochaete chrysosporium联合包埋固定，结果表明了复合固定化体系能更加有效地用于降解五氮酚，显示出复合载体材料的优越性。
5
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