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第三节蛋白质工程
1.蛋白质工程是指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造蛋白质，甚至创造出自然界不存在的蛋白质的技术。
2．蛋白质工程的关键技术是基因工程。
3．蛋白质工程的一般过程是：预期蛋白质功能→分子设计蛋白质→合成相应基因→基因指导新蛋白质合成。
4．实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质结构和功能的关系。
5．根据蛋白质被改动部位的多少，可将蛋白质改造类型分为“大改”、“中改”和“小改”。
6．通过蛋白质工程，可获得热稳定性高的酶和新型药物。
蛋白质工程概述
1．蛋白质工程的概念
(1)手段：
①通过物理化学和生物化学等技术了解蛋白质的结构和功能。
②借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因。
(2)目的：定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质。
(3)关键技术：基因工程。蛋白质工程又称第二代基因工程。
2．蛋白质工程的一般过程
先根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构，进而设计对应的氨基酸序列，在此基础上合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列(基因)，再利用基因工程技术合成新的蛋白质。
3．改造蛋白质的方式
改造方式
相关操作
大改
根据氨基酸的性质和特点，设计并制造出自然界中不存在的全新蛋白质，使之具有特定的氨基酸序列、空间结构和预期功能
中改
改变蛋白质分子中某一个多肽片段或一个特定的结构
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小改
通过基因工程中的定点诱变技术，有目的地改造蛋白质分子中某活性部位的一个或几个氨基酸残基，以改善蛋白质的性质和功能
1．对天然蛋白质进行改造，是通过直接对蛋白质分子进行操作来实现的吗？
提示：不是，由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过改造基因来完成。
2．蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？
提示：基因工程是按照中心法则进行的：基因→表达(转录和翻译)→形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程却与之相反，一般是先创造出适合人类需求的新基因，然后使其表达出具有特定结构和功能的蛋白质。蛋白质工程可以创造出自然界不存在的蛋白质。
3．假如某科学家设计出某种蛋白质的空间结构，你能否设计出利用大肠杆菌生产该蛋白质的流程？
提示：蛋白质的空间结构→氨基酸序列→合成目的基因→构建基因表达载体→导入大肠杆菌→产生相应蛋白质。
4．PCR技术在基因定点诱变中的技术流程是什么？
提示：先人工合成带有突变位点的引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因，再通过基因工程方法，将突变基因导入受体细胞，经过转录和翻译就可合成所需的蛋白质。
1．蛋白质工程的操作步骤
(1)从生物体中分离纯化目的蛋白。
(2)测定其氨基酸序列。
(3)借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构。
(4)设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响。
(5)设计编码该蛋白质的基因改造方案，如定点突变。
(6)分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。
[特别提醒] 蛋白质工程并不是直接改造蛋白质，而是通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造，主要原因如下：
①
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任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质还是无法遗传的。
②对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。
2．定点诱变技术和非定点诱变技术
(1)定点诱变技术：基因的定点诱变技术是改变蛋白质结构的核心技术之一。
项目
内容
条件
原料
脱氧核苷酸
酶
DNA多聚酶(聚合酶)和DNA连接酶
引物
含突变位点的DNA分子片段
操作方法
PCR技术
结果
后代中半数为诱变的DNA分子
适用范围
空间结构完全清楚的蛋白质，进行“小改”
特点
定点诱变有目的性和针对性
(2)非定点诱变技术：
①适用对象：对于不能预先确定诱变位点的蛋白质，可采用非定点诱变技术来进行蛋白质的改造。
②特点：非定点诱变突变位点多，有时甚至会产生出意想不到的改造效果。
3．基因工程与蛋白质工程的比较
项目
基因工程
蛋白质工程
区
别
起点
目的基因
预期蛋白质功能
过程
获取目的基因→构建基因表达载体→导入目的基因→检测和鉴定目的基因→实现功能表达
蛋白质结构分析→结构预测与设计→基因工程→蛋白质纯化→功能分析
实质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
定向改造和生产人类所需的蛋白质
结果
生产自然界已存在的蛋白质
定向改造天然蛋白质，甚至创造出自然界不存在的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质必须通过基因工程才能实现
[特别提醒] 基因工程和蛋白质工程生产出的蛋白质不同
①基因工程中目的基因是自然存在的基因，只能生产出自然界中已存在的蛋白质。
②
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蛋白质工程中所涉及的基因不是自然存在的，是改造过的自然存在的基因，因此能够生产出自然界中不存在的蛋白质。
蛋白质工程的应用
1．提高酶的热稳定性
方法一：将酶分子中的天门冬酰胺和谷氨酰胺转变为其他氨基酸。
方法二：在蛋白质分子中引入二硫键。
2．生物工程制药
(1)实例1：鼠源杂交瘤抗体的改造。
①改造方法：在基因水平上对抗体进行重组，产生人恒定区和鼠可变区嵌合抗体。
②结果：对人体的不良反应减少。
(2)实例2：对tPA的改造。
①tPA功能：溶解血栓块，医治心肌梗死等疾病。
②改造方法：将tPA分子中的天门冬酰胺替换为谷氨酰胺。
③结果：tPA在血液循环中停留时间大大延长，疗效更加显著。
1．一般的藻类植物仅能生活在40 ℃以下的水环境中，但也有少数种类的藻类植物可以生活在80 ℃以上的温泉中。从酶的角度考虑其主要原因是什么。
提示：温泉藻类植物体内酶肽链中的某些氨基酸与一般藻类植物的不同，使酶的热稳定性增强。
2．人类正常血红蛋白(HbA)β链第63位氨基酸是组氨酸，其密码子为CAC或CAU，当β链第63位组氨酸被酪氨酸(UAU或UAC)替代后，出现异常血红蛋白(HbM)，导致一种贫血症，β链第63位组氨酸被精氨酸(CGU或CGC)所替代而产生的异常血红蛋白(HbZ)将引起另一种贫血症。
(1)写出正常血红蛋白基因中，决定β链第63位组氨酸密码子的碱基对组成。
提示：GTG或GTA。
(2)若将正常的基因片段导入贫血症患者骨髓造血干细胞，则可以达到治疗目的。请问：此操作属于蛋白质工程吗？为什么？
提示：不属于蛋白质工程。因为此操作是将健康的正常的目的基因导入有缺陷的受体细胞，合成的蛋白质仍是天然存在的蛋白质，属于基因工程技术。
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蛋白质工程的应用
(1)提高蛋白质的稳定性：
①通过基因的体外定点诱变技术替换原有氨基酸。
②增加蛋白质中二硫键数量。
(2)融合蛋白质：用化学合成法将控制不同蛋白质的基因连接，在大肠杆菌中可以表达出融合蛋白。
(3)改变蛋白质的活性：科学家将胰岛素β链中的第28位的脯氨酸和第29位的亮氨酸交换位置，即可获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床实验。
(4)治癌酶的改造：癌症的基因治疗分两个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。通过改造治疗癌症的酶，能够达到更好的治疗效果。
(5)嵌合抗体和人缘化抗体：通过蛋白质工程对抗体进行改造，增强机体的免疫力。
以对概念的比较分析为依据，考查基因工程和蛋白质工程的异同
[例1] 下列关于基因工程和蛋白质工程的说法正确的是( )
A．蛋白质工程和基因工程的目的都是获得人类需要的蛋白质，所以二者没有区别
B．基因工程是蛋白质工程的关键技术
C．通过蛋白质工程改造后的蛋白质有的仍然是天然的蛋白质
D．利用蛋白质工程可以在大肠杆菌细胞中得到人的胰岛素
[精讲精析] 蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。其中，基因工程是关键技术，是蛋白质工程的基础，因为对蛋白质结构的改造是通过改造基因来实现的，所以蛋白质工程是在基因水平上改造蛋白质，改造后的蛋白质不再是天然的蛋白质。利用大肠杆菌生产人胰岛素属于基因工程。
[答案] B
基因工程和蛋白质工程的判断方法
(1)对基因的操作方法：
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如果仅将基因用限制性核酸内切酶酶从DNA片段中切割下来，没有经过对编码蛋白序列进行修饰、加工，或仅对其调控序列进行加工，则属于基因工程；如果将目的基因经过了一些实质性的改造，如对编码蛋白序列进行了碱基替换或增添或去除了某几个碱基，则属于蛋白质工程。
(2)目的基因的合成方式：
基因工程和蛋白质工程中都可以通过反转录合成目的基因，或根据蛋白质的氨基酸序列先合成mRNA，再合成基因。如果合成时mRNA或氨基酸序列没有经过改造，则为基因工程技术；如果mRNA或氨基酸序列经过了改造，或mRNA或氨基酸序列是根据蛋白质预期的功能人工设计的，则为蛋白质工程技术。
(3)合成的蛋白质种类：
如果合成的蛋白质是天然蛋白质，则是基因工程；如果合成的蛋白质和天然蛋白质有差异，甚至是自然界中所没有的，则为蛋白质工程。
下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是( )
A．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，而蛋白质工程可以对现有蛋白质进行改造，从而制造一种新的蛋白质
B．基因工程和蛋白质工程产生的变异都是可遗传的
C．当得到可以在－70 ℃条件下保存半年的干扰素后，在相关酶、氨基酸和适宜的温度、pH条件下，干扰素可以大量自我合成
D．蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，蛋白质工程最终还是要通过基因修饰或基因合成来完成
解析：选C 利用蛋白质工程生产蛋白质产品应通过改造相应基因后，再经基因表达大量产生。
以蛋白质工程设计流程图为载体，考查蛋白质工程的应用
[例2] 胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，要经过较长的时间才能进入血液，而进入血液中的胰岛素又容易被分解，因此，治疗效果受到影响。下图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：
(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是________________。
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(2)通过DNA合成形成的新基因应与________结合后转移到________________中才能得到准确表达。
(3)若要利用酵母菌生产速效胰岛素，效率会比用大肠杆菌高，原因是_____________
________________________________________________________________________
(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
(5)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因除图中方法外还可以采用________技术，其中________技术是目前常用方法之一。
[思路点拨]
[精讲精析] (1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是胰岛素的预期功能，即速效胰岛素。(2)合成的目的基因应与载体构建重组DNA分子后导入受体细胞中才能得以表达。(3)酵母菌为真核生物，细胞中具有内质网、高尔基体等细胞器，可以对核糖体合成的肽链进行加工，使其成为具有特定功能的蛋白质。(4)从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因，其基本设计思路是根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出基因中的脱氧核苷酸序列，然后用DNA合成仪直接合成出新的基因。(5)从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因除人工合成外，还可以采用基因定点诱变技术，其中PCR技术是目前常用的方法之一。
[答案] (1)预期新胰岛素的功能
(2)载体 大肠杆菌等受体细胞
(3)酵母菌细胞中具有内质网、高尔基体等细胞器，可对肽链进一步加工。
(4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列→推测出基因中脱氧核苷酸序列→用DNA合成仪人工合成新的基因。
(5)基因定点诱变 PCR
[课堂回扣练习]
1．关于蛋白质工程的说法，正确的是( )
A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作
B．蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子
C．对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的
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D．蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的
解析：选B 所谓蛋白质工程，应是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子。
2．蛋白质工程正确的基本操作程序是( )
①蛋白质分子结构合成 ②DNA合成 ③mRNA合成
④蛋白质的预期功能 ⑤根据氨基酸的序列推出脱氧核苷酸的序列
A．①→②→③→④→⑤→①
B．⑤→④→③→②→①→②
C．④→①→⑤→②→③→①
D．②→③→⑤→①→②→④
解析：选C 蛋白质工程的操作流程为：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
3．蛋白质芯片可用于( )
①检测血清样品中的特异性抗体
②检测某人是否感染某种病原微生物
③检测体内的特异性抗体的动态变化
④检测所有传染病菌
A．①② B．③④
C．①③④ D．①②③
解析：选D 蛋白质芯片是用于检测某人是否感染某种病原微生物的高效检测系统，能检测出送检血清样品中的特异性抗体、能够检测某人是否感染某种病原微生物，也能检测体内的特异性抗体的动态变化。但一种蛋白质芯片只能针对某种病原微生物进行检测，而不能检测所有病原菌。
4．基因工程与蛋白质工程的区别是( )
A．基因工程需对基因进行分子水平操作，蛋白质工程不需对基因进行操作
B．基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以是自然界不存在的蛋白质
C．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平(或性状水平)操作
D．基因工程完全不同于蛋白质工程
解析：
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选B 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。蛋白质工程是从分子水平上对蛋白质进行改造设计，通过对相应的基因进行修饰加工，甚至人工进行基因合成，从而对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活需求；而基因工程只是将外源基因导入另一生物体内，并使之表达，体现人类所需的性状，或者获取所需的产品，基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。
5．科研人员通过蛋白质工程来设计改变酶的构象。在研究溶菌酶的过程中，得到了多种突变酶，测得酶50%发生变性时的温度(Tm)，部分结果见下表：
酶
半胱氨酸(Cys)的位置和数目
二硫键数目
Tm/℃
野生型T4溶菌酶
Cys51，Cys97
无
41.9
突变酶C
Cys21，Cys143
1
52.9
突变酶F
Cys3，Cys9，
Cys21，Cys142，Cys164
3
65.5
注：Cys右上角的数字表示半胱氨酸在肽链中的位置。
(1)溶菌酶热稳定性的提高，是通过改变________________________________________
和增加________得以实现的。
(2)从热稳定性高的酶的氨基酸序列出发，利用________方法获得目的基因，通过基因工程的手段，可以生产自然界中不存在的蛋白质。
解析：(1)分析表格信息并比较3种酶的二硫键数目可以看出：二硫键数目越多，酶的热稳定性越高；野生T4溶菌酶与突变酶C中半胱氨酸的位置不同，酶的热稳定性不同；野生型T4溶菌酶、突变酶C与突变酶F的半胱氨酸数目不同，酶的热稳定性不同。(2)从氨基酸序列出发可推测mRNA的碱基序列，进一步推测基因的脱氧核苷酸序列，最后人工合成目的基因。
答案：(1)半胱氨酸的位置、数目 二硫键的数目
(2)人工合成(化学合成)
[课下综合检测]
一、选择题
1．下列关于蛋白质工程的说法，错误的是( )
A．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要
B．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构
C．蛋白质工程能产生自然界中不曾存在的新型蛋白质分子
D．蛋白质工程与基因工程密不可分，又称为第二代基因工程
解析：选B 蛋白质工程被称为第二代基因工程，是对基因结构进行相应地改造，从而产生新的蛋白质，对蛋白质直接改造，改造后不能够遗传，也不能大量生产。
2．蛋白质工程中需要直接进行操作的对象是( )
A．氨基酸结构 B．蛋白质空间结构
C．肽链结构 D．基因结构
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解析：选D 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求。因此，归根到底，还是要对基因进行改造。
3．人们发现蛛丝蛋白比蚕丝蛋白更细，但强度却更大，于是有人试图通过破解蛛丝蛋白的结构从而推出其基因结构，以指导对蚕丝蛋白基因的修改，从而让蚕也吐出像蛛丝一样坚韧的丝。此过程的名称和依据的原理分别是( )
A．基因突变：DNA→RNA→蛋白质
B．基因工程：RNA→RNA→蛋白质
C．基因工程：DNA→RNA→蛋白质
D．蛋白质工程：蛋白质→RNA→DNA→RNA→蛋白质
解析：选D 通过修改已知蚕丝蛋白的基因，从而创造出全新的蛋白质的过程属于蛋白质工程技术，其设计原理是：蛋白质→RNA→DNA→RNA→蛋白质。
4．关于蛋白质工程的设计思路，说法不正确的是( )
A．从蛋白质的功能推测蛋白质应有的结构
B．从蛋白质的结构推测氨基酸的排列顺序
C．从氨基酸的排列顺序推测基因中脱氧核苷酸的排列顺序
D．蛋白质工程完全不遵循中心法则
解析：选D 蛋白质工程的基本途径是根据中心法则反推出来的。
5．对于蛋白质的改造类型有“大改”“中改”“小改”之分，其划分依据是( )
A．蛋白质分子的复杂程度
B．操作过程的复杂程度
C．蛋白质被改造部位的多少
D．蛋白质数目的多少
解析：选C 利用基因工程的方法对蛋白质进行改造，根据蛋白质被改造部位的多少，可以将蛋白质的改造类型分为“大改”、“中改”和“小改”三种。
6．科学家将β干扰素基因进行定点突变导入大肠杆菌中表达，使干扰素第十七位的半胱氨酸改变成丝氨酸，结果大大提高了β干扰素的抗病活性，并且提高了储存稳定性。该生物技术为( )
A．基因工程 B．蛋白质工程
C．基因突变 D．组织培养
解析：选B 题目中的操作中涉及的基因显然不再是原来的基因，其合成的β干扰素也不是天然β干扰素，而是经过改造的、具有人类所需优点的蛋白质，因而整个过程利用的生物技术应为蛋白质工程。
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7．某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，只是其热稳定性较差，进入人体后容易失效。现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗食物消化不良，最佳方案是( )
A．替换此酶中的少数氨基酸，以改善其功能
B．将此酶与人蛋白酶进行拼接，形成新的蛋白酶
C．重新设计与创造一种蛋白酶
D．减少此酶在片剂中的含量
解析：选A 要想使蛋白酶热稳定性有所提高，就要改变蛋白质的结构，此类问题一般是对蛋白质中的个别氨基酸进行替换。
8．(广东高考)从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是( )
A．合成编码目的肽的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
解析：选C 该基因的表达产物多肽P1的抗菌性和溶血性均很强，要研发出抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先应根据P1的氨基酸序列设计模拟肽，再构建相应的DNA片段。
二、非选择题
9．下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答问题：
(1)代表蛋白质工程操作思路的过程是____________，代表中心法则内容的是____________。(填写数字)
(2)写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容：
①____________，②____________，③____________，
④____________，⑤____________。
(3)蛋白质工程的目的是_____________________________________________________，
通过________________________________________________________________________实现。
(4)从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是________的。
解析
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：天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，而蛋白质工程的基本途径与之相反，即从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列(基因)。
答案(1)④⑤ ①②③
(2)转录 翻译 折叠 分子设计 DNA合成
(3)对蛋白质的结构进行分子设计 基因修饰或基因合成
(4)相反
10．绿色荧光蛋白(GFP)能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光，这样借助GFP发生的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况，帮助推断蛋白质的功能。下图为我国首例绿色荧光蛋白(GFP)转基因克隆猪的培育过程示意图，据图回答：
(1)图中通过过程①、②形成重组质粒，需要限制性核酸内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的1个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
①请画出质粒被限制性核酸内切酶Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。
②在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制性核酸内切酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？________，理由是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多也最有效的方法是________。
(3)如果将切取的GFP基因与抑制小猪抗原表达的基因一起构建到载体上，GFP基因可以作为基因表达载体上的标记基因，其作用是________________________________________。
获得的转基因克隆猪，可以解决的医学难题是________________________。
(4)目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：______________(用序号表示)。
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计
③蓝色荧光蛋白基因的修饰(合成)
④表达出蓝色荧光蛋白
解析：(1)①书写要关注DNA序列与限制性核酸内切酶识别序列的区别，不要遗漏了酶和黏性末端的正确表达。②
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由于两种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端是相同的，可以互补配对，因此可用DNA连接酶进行相互“缝合”。(2)基因工程中目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法。(3)基因表达载体上标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因；获得转基因猪，可以解决医学上供体器官不足和免疫排斥问题。(4)蛋白质工程正确的操作过程是②①③④。
答案：(1)①(只写出切割后形成的部分即可)
②可以连接 因为由两种不同限制性核酸内切酶切割后形成的黏性末端是相同的(或是可以互补的)
(2)显微注射法
(3)鉴定受体细胞中是否含有目的基因 供体器官不足和免疫排斥
(4)②①③④
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