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血红蛋白的提取和分离
一、选择题
1．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( )
A．具有相同的相对分子质量
B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子
C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子
D．相对分子质量不同，但都在一定范围之内
解析：选D 相对分子质量大小不同的多种成分在通过凝胶时，按照相对分子质量大小“排队”，从而将各种成分分开。在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
2．下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是( )
A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心
B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌
C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离
D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h
解析：选C 红细胞洗涤过程中应该用生理盐水，不能用蒸馏水；血红蛋白的释放应该加入蒸馏水和甲苯，使红细胞吸水涨破，释放其中的血红蛋白；将搅拌好的混合液通过离心、过滤后，用分液漏斗分离出血红蛋白溶液；透析所用的磷酸缓冲液的pH为7.0。
3．下列关于凝胶色谱法的原理及操作，错误的是( )
A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法
B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出；小分子因进入凝胶内部而流速缓慢，后流出
C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系
D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来
解析：选C 选用不同种凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离出的分子大小也不同。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所有要分离的物质都应该被洗脱出来，这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。
4．下列关于凝胶柱上加入样品和洗脱操作的叙述，错误的是( )
A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
B．让吸管管口沿管壁环绕移动贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面
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C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱
D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液
解析：选C 样品完全进入凝胶层后，加入磷酸缓冲液到适当高度，再连接缓冲液洗脱瓶，开始洗脱。
5．凝胶色谱柱制作的程序一般是( )
①橡皮塞打孔 ②挖凹穴 ③装玻璃管 ④盖尼龙网 ⑤盖尼龙纱 ⑥将橡皮塞插入玻璃管 ⑦接尼龙管、装螺旋夹 ⑧柱顶插入安装了玻璃管的橡皮塞
A．①→③→④→⑤→⑥→⑧→⑦→②
B．①→②→③→④→⑤→⑥→⑦→⑧
C．①→②→③→④→⑥→⑤→⑧→⑦
D．①→②→③→⑦→⑥→⑤→⑧→④
解析：选B 凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管→选择合适的橡皮塞→打孔→挖凹穴→装玻璃管→盖尼龙网→盖尼龙纱→将橡皮塞插入玻璃管→接尼龙管→装螺旋夹→柱顶插入安装了玻璃管的橡皮塞。
6．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述错误的是( )
A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质
C．可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
解析：选A 蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此透析可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。
7．在提取和分离猪血红蛋白的实验中，应使用( )
A．柠檬酸钠溶液洗涤红细胞，防止红细胞破裂
B．蒸馏水和甲苯处理红细胞，使其释放出血红蛋白
C．生理盐水透析血红蛋白溶液，保持血红蛋白活性
D．生理盐水洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动
解析：选B 柠檬酸钠可与血浆中的钙离子结合，防止血液凝固；在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白；透析用的是磷酸缓冲液；磷酸缓冲液有利于血红蛋白在凝胶柱中移动。
8．以下关于猪血红蛋白的分离与提取的描述，正确的是( )
A．透析的目的是去除样品中分子量较大的杂质
B．血红蛋白释放后应进行低速短时间离心
C．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢
D．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
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解析：选D 透析可以除去分子量较小的杂质；血红蛋白释放后，以2 000 r/min的高速离心10 min，从而分离血红蛋白溶液；凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较大的在凝胶外部移动，移动速度快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况。
9．下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离实验的叙述，错误的是( )
A．可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质
B．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质
C．透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜
D．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法
解析：选A 猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，不能从其红细胞中提取出DNA。
10．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、所带电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关该样品中蛋白质的分离的叙述，正确的是( )
A．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内
B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中
D．若用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远
解析：选A 分子甲的相对分子质量最小，会进入凝胶内部通道而移动速度慢；若分子乙留在透析袋内，说明其相对分子质量比较大，分子丙比分子乙相对分子质量大，所以分子丙也留在袋内；分子戊比分子甲的相对分子质量大，分子戊存在于沉淀中分子甲可能不在沉淀物中；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的样品，其电泳迁移率完全取决于分子的大小，相对分子质量相差越大，形成的电泳带相距越远，故分子甲和分子丙形成的电泳带相距最远。
二、非选择题
11．对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：
(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________________________________________、
____________、____________和纯度鉴定。
(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前要在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是________________。
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(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、________和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶液时需要用到____________(仪器)分出下层红色透明液体。
(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。
①透析的目的是________________________________________________；
②透析的原理是_______________________________________________。
(5)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是_____________________________；
②血红蛋白的特点是_______________________________________；
这一特点对分离血红蛋白的意义是_____________________________________。
解析：透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内，所以透析可以除去相对分子质量较小的杂质；样品纯化的目的是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去；血红蛋白呈现红色，在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时期；同时，通过观察颜色，使血红蛋白的分离过程更直观，大大简化了实验操作。
答案：(1)样品处理 粗分离 纯化 (2)防止血液凝固 (3)血红蛋白的释放 分液漏斗 (4)①去除相对分子质量较小的杂质 ②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内 (5)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去 ②呈现红色 在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
12．如图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：
(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是______________________________。
(2)图甲表示________________过程，该操作目的是去除样品中____________________的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以________________________________________________________________________
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(写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：______________________________________________。
(3)图乙是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是________________。在进行④操作时要________(填“打开”或“关闭”)下端出口。
(4)图丙为用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法________(填“可靠”或“不可靠”)，理由是__________________________________________________。
解析：(1)生理盐水与红细胞内液为等渗溶液，故用其洗涤红细胞主要是防止红细胞吸水破裂。(2)图甲表示血红蛋白粗提取过程，也称为透析过程。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质；若要尽快达到理想的透析效果，可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法。透析袋是一种半透膜，双缩脲试剂可以透过半透膜，进入袋内与血红蛋白反应，生成紫色物质。(3)根据教材中往色谱柱中加样的顺序可知，正确的排序为②③④①；图中进行④操作是在样品上部添加缓冲液，此时要关闭下端出口。(4)电泳的原理是利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的大小、形状等的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，本实验只能判断肽链的大小，而不能判断其条数。
答案：(1)防止红细胞吸水破裂
(2)透析(粗分离) 相对分子质量较小 增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液) 出现紫色，因为双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血红蛋白反应，生成紫色物质
(3)②③④① 关闭 (4)不可靠 只能得出提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链，不一定是两条
13.凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前该技术不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是_________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由____________________________________________________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是__________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体______(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是___________________________________________。
(5)若选用SephadexG75，则“G”表示_____________________________________，“75”表示_______________________________________________________________________。
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解析：(1)原理：不同蛋白质的相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的蛋白质则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。(2)凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。(3)凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(4)样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶时所用的液体均是物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。
答案：(1)a a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快
(2)尼龙网和尼龙纱 (3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 (4)相同 保持稳定 (5)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g
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