基因工程
精选大题
例：（2018全国卷II)某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________。使用这两种酶进行酶切是为了保证_______________，也是为了保证__________________。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和_________过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_____________移入牛的____________中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
【答案】（1）E1和E4 甲的完整甲与载体正确连接
（2）转录翻译
（3）细胞核去核卵母细胞
（4）核DNA
【解析】（1）要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5ˊ末端而获得的L1-GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。（2）构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白（GFP）”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。（3）若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。（4）PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
模拟精做
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1．（2018届黑龙江省普通高等学校招生全国统一考试仿真模拟（十)）马铃薯含有丰富的淀粉、氨基酸、多种维生素和无机盐，是种植广泛的农作物。侵染病毒后导致产量大幅下降，培育脱毒和抗毒的马铃薯品种是提高产量的有效方法。请回答下列问题：
（1）利用马铃薯的茎尖进行离体培养可以获得脱毒苗，原因在于____________________，该过程依据的原理是_________________________________。
（2）为获得抗病毒的马铃薯植株，往往采用转基因技术，将病毒复制酶基因转移到马铃薯体内。其过程大致如图所示：
①构建基因表达载体过程中需要用__________（酶）处理。目的基因转录过程中，__________能使转录在所需要的地方停止下来。
②将目的基因导入马铃薯细胞使用了__________法，要用__________处理土壤农杆菌，使之转变为感受态，然后将它们在缓冲液中混合培养以完成转化过程。
③目的基因导入马铃薯细胞后，是否可以稳定维持和表达，要通过检测与鉴定，马铃薯的DNA上是否插入了目的基因的检测方法是____________________。
（3）生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低病毒的__________基因频率的增长速率。
【答案】（1）茎尖病毒极少甚至无病毒（植物）细胞具有全能性
（2）①限制酶（或限制性核酸内切酶）和DNA连接酶终止子②农杆菌转化Ca2+③DNA分子杂交技术
（3）抗性
【解析】（1）马铃薯茎尖病毒极少甚至无病毒，可以用来培养脱毒苗，植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。（2）①构建基因表达载体，需要的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，基因表达载体中的终止子使转录在所需要的地方停止下来。②将外源基因导入植物体内用农杆菌转化法，用Ca2+处理土壤农杆菌，使之转变为感受态，使外源基因容易导入。③DNA上是否插入了目的基因的检测方法是DNA分子杂交技术。（3）转基因作物与非转基因作物混合播种，可降低抗性作物对害虫的选择性，使害虫种群中的抗性基因频率增长率减慢。
2．（2019届河南省洛阳市高三上学期尖子生第一次联考）科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗，其技术流程如下图。请回答相关问题：
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(1)过程①获得重组胚胎之前，需要通过____________技术获得重组细胞。
(2)将基因导入ES细胞而不是导入到上皮细胞，是因为__________________。
(3)步骤③中，需要构建含有干扰素基因的__________。由于DNA复制时，子链只能由5′向 3′方向延伸，故构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取_______________作为引物。对干扰素基因片段和质粒进行酶切时，可选用限制酶的组合为________________或_______________。
(4)将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发___________色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否表达，可以采用_____________的方法。
【答案】（1）核移植
（2）ES细胞具有发育的全能性
（3）基因表达载体B和CHindⅢ和PstⅠEcoRⅠ和PstⅠ
（4）绿抗原-抗体杂交
【解析】 (1) 图1是利用胚胎干细胞（ES 细胞）对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗的流程，其中过程①采用了动物细胞核移植技术。(2) 图1中的ES细胞是取自于囊胚期的内细胞团。ES细胞在功能上具有发育的全能性，体外诱导ES细胞可以使其向不同方向分化，所以将目的基因导入ES细胞而不是上皮细胞。(3) 步骤③是将干扰素基因（目的基因）导入ES细胞中，在导入之前需要构建含有干扰素基因的基因表达载体。因DNA复制时，子链总是从5′向 3′方向延伸，子链与模板链反向平行，所以利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2的A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C片段作为引物。由图2可以看出，用限制酶SmaⅠ切割会破坏干扰素基因，为将完整的干扰素基因切割下来，需要利用限制酶组合HindⅢ和 PstⅠ或 EcoRⅠ和 PstⅠ切割干扰素基因的两端，这样也可以使如图3所示质粒上保留一个完整的标记基因，即绿色荧光蛋白基因。(4) 综上分析，在构建的重组质粒上，红色荧光蛋白基因的结构已经被破坏，但绿色荧光蛋白基因的结构完整，因此将步骤③获得的 ES 细胞在荧光显微镜下观察，应选择只发绿色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否表达，需采用抗原-抗体杂交技术，若有杂交带出现，表明干扰素基因已经成功表达。
3．（2019届河南省示范性高中高三上学期期终考试）马铃薯是全球第四大重要的粮食作物，仅次于小麦、水稻和玉米。近年来对马铃薯育种的研究越来越多。请回答下列问题
(1)马铃薯在无性繁殖过程中感染的病毒易传播给后代，从而影响后代的产量和品质，可采用___________技术来脱除病毒，原因是_________________________________。
(2)科学家常采用___________法将控制HPV-16病毒(人宫颈癌病毒)外壳蛋白合成的基因导入马铃薯细胞，培育出可生产的且抗该病毒的转基因马铃薯，人食用后可获得抗性。若要使目的基因在受体细胞中表达，需要构
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建基因表达载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是______________________、______________________。实验发现，该转基因马铃薯经烹煮后抗病毒效果较差，分析其原因可能是
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(3)转基因食品的安全性备受关注，若要确定某食品是不是转基因生物或是通过转基因技术加工而成的，可以从______________________、______________________等方面进行检测。
【答案】（1）茎尖组织培养植物分生区附近如茎尖的病毒极少，甚至无病毒
（2）农杆菌转化目的基因无复制原点目的基因无表达所需的启动子烹煮时，高温破坏了病毒外壳蛋白的空间结构，使其抗病毒的功能丧失
（3）检测其是否含有外源基因或DNA 检测其是否含有外源基因表达的蛋白质
【解析】（1）根据分析可知，马铃薯茎尖病毒极少甚至无病毒，因此可将马铃薯茎尖接种在培养基中，经过组织培养获得脱毒苗。（2）马铃薯为双子叶植物，将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法为农杆菌转化法。启动子位于基因的首端，它是RNA聚合酶结合和识别的部位，有了它才能启动基因转录，由于目的基因无复制原点、无表达所需的启动子，故需要将目的基因与运载体结合构建形成基因表达载体，然后再导入受体细胞。由于目的基因表达的产物是病毒外壳蛋白，烹煮时，高温破坏了病毒外壳蛋白的空间结构，使其抗病毒的功能丧失，故该转基因马铃薯经烹煮后抗病毒效果较差。（3）基因工程是将外源基因导入受体细胞并在细胞内表达的过程。若要确定某食品是不是转基因生物或是通过转基因技术加工而成的，可以检测其是否含有外源基因或DNA以及检测其是否含有外源基因表达的蛋白质等方面进行检测。
4．（2019届安徽省芜湖市高三上学期期末考试）国际水稻研究所人员从产量低的耐淹水稻中找到一种耐淹基因，将其移入到高产热带水稻中，终于培育出耐淹的高产水稻品系，其产量比高产热带水稻产量还要高。耐淹基因移入的方法可通过转基因技术实现。请回答下列相关问题：
（1）为培育耐淹的高产水稻品系，应需将耐淹基因进行体外扩增。在PCR反应体系中加入了热稳定DNA聚合酶、引物等，还加入耐淹基因作为___________，加入___________作为合成DNA的原料。
（2）质粒常被用作运载体，因为质粒具有___________（答2点即可）。构建耐淹基因的质粒表达载体时，常用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，目的是___________。
（3）根据耐淹基因表达的蛋白质，研究人员通过对它的氨基酸序列设计并人工合成耐淹基因。与水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在结构上缺少了___________。虽然两种基因转录的产物不同，但最终表达出相同的蛋白质，可能原因是___________。
（4）蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质的原因是___________。
【答案】（1）模板 dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)
（2）能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，方便剪切；具有标记基因，便于检测和筛选减少耐淹基因及质粒的自身环化、增大耐淹基因正向（正确）连接的概率
（3）启动子、终止子和内含子密码子具有简并性
（4）改造基因易于操作且改造后能够遗传
【解析】 (1)利用PCR技术在体外扩增耐淹基因（目的基因）时，在PCR反应体系中除了加入热稳定DNA聚合酶、引物等外，还加入耐淹基因作为模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 作为合成DNA的原料。(2)
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质粒被用作运载体，应具备的条件有：能在宿主细胞内复制并稳定存在；具有多个限制酶切位点，方便剪切；具有标记基因，便于检测和筛选。构建耐淹基因的质粒表达载体时，用不同的限制酶对耐淹基因和质粒进行切割，可以减少耐淹基因及质粒的自身环化、使耐淹基因定向连接到质粒上，以增大耐淹基因正向（正确）连接的概率。(3) 与水稻的耐淹基因相比，根据耐淹基因表达的蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA分子中，缺乏与基因中的启动子、终止子和内含子相对应的碱基序列，据此设计并人工合成的耐淹基因在结构上缺少了启动子、终止子和内含子。由于密码子具有简并性，虽然两种基因转录的产物不同，但最终能够表达出相同的蛋白质。(4)由于直接改造的蛋白质不能遗传，而改造基因易于操作且改造后能够遗传，所以在蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质。
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