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土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
一、选择题
1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，错误的是( )
A．土壤取样时应选取距地表约3～8 cm的土壤层
B．测定细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液
C．土壤中能合成脲酶的细菌能分解尿素
D．向以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红溶液可以鉴定出分解尿素的细菌
解析：选D 鉴定分解尿素的细菌时需向以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
2．分离土壤中分解尿素的细菌时，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
解析：选C 土壤中分解尿素的细菌能够合成脲酶，将尿素分解生成氨，利用尿素中的氮合成自身有机物。培养基中尿素作为唯一氮源，分解尿素的细菌能生长，其他微生物不能生长；分离微生物要用固体培养基，需要加琼脂；土壤中分解尿素的细菌属于异养微生物，需要加葡萄糖作为碳源。
3．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
解析：选D 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数。
4．下列操作需要在火焰旁进行的是( )
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液
④涂布平板 ⑤微生物的培养
A．①②③④⑤ B．②③④⑤
C．③④⑤ D．②③④
解析：选D 实验操作过程要进行严格的无菌操作，除实验空间必须消毒外，每个操作步骤都必须在无菌区进行。土壤的称取、溶液的稀释、涂布平板都需要在酒精灯火焰旁的无菌区(或接种箱内的酒精灯火焰旁)完成，以防止杂菌污染。
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5．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分离出的是( )
A．大肠杆菌 B．霉菌
C．放线菌 D．固氮细菌
解析：选A 固氮微生物的生长不需要从培养基上获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长；加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放线菌，则可收获霉菌；加入酚的培养基使细菌和霉菌不能正常生长，而放线菌却能利用酚作为原料合成自身产物。
6．在做分离分解尿素的细菌实验时，一同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。该同学的结果产生的原因可能有( )
①土样不同 ②培养基被污染 ③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
解析：选A 实验结果不同，最可能的原因是土样不同，其次是操作失误或培养基被污染，而与是否设置对照没有关系。
7．三个培养皿中分别加入10 mL不同的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36 h后，计算菌落数，结果如下表。下列相关叙述正确的是( )
培养皿
培养基成分
菌落数
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A．该实验采用的是液体培养基
B．该实验采用平板划线法接种
C．Ⅰ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子
D．Ⅱ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖
解析：选D 该培养基加入了琼脂，故为固体培养基；对微生物进行计数时宜采用稀释涂布平板法接种，而不是平板划线法接种；Ⅰ与Ⅲ中有葡萄糖、生长因子两种变量，不能得出相应结论；Ⅱ和Ⅲ对照，自变量是有无葡萄糖，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖。
8．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( )
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A．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
B．如果要测定②中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法
C．若图中④为对照实验，则其中应以苯酚作为唯一的碳源
D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落
解析：选C 用苯酚作为选择培养基中的碳源，也是微生物的能源物质，会影响其他微生物生长。测定培养液中细菌数目常采用稀释涂布平板法。若④为对照实验，则④中应含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚作为唯一碳源。使用稀释涂布平板法或平板划线法都可以在⑥上获得单菌落。
9．关于土壤中细菌的分离，下列正确的操作步骤是( )
①土壤取样 ②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1 mL进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107倍的稀释液
A．①→②→③→④ B．①→③→②→④
C．①→②→④→③ D．①→④→②→③
解析：选C 在分离土壤中某种细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。
10．下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是( )
A．可采用干热灭菌法对微生物培养基进行灭菌
B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法
C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度
D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
解析：选A 培养基灭菌通常用的是高压蒸汽灭菌法，而干热灭菌法通常适用于玻璃器皿、金属用具等耐高温且不适合其他方法的物品；分离能分解尿素的细菌，用的选择培养基里尿素是唯一的氮源，这样才能分离出分解尿素的细菌。
二、非选择题
11．多氯联苯是一种对人体有很大危害的有机物，呈油状液体，污染土壤后，很难清除。研究发现部分酵母菌具有分解多氯联苯的作用。为消除这种污染，科研人员计划从受污染的土壤中筛选出高效分解多氯联苯的菌株。
(1)筛选分解多氯联苯的菌株时，应将土壤样品______________，接种到以____________为唯一碳源的培养基上，从功能上讲，该培养基属于____________。
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(2)对初步提取到的菌株要进行____________，一般操作方法有两种，如图是____________法。
(3)若要测定培养液酵母菌的菌体数，可在显微镜下直接计数。若用________法统计菌落数，在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板进行培养一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________。
(4)将1 mL酵母菌溶液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57、58，据此可得出每升溶液中酵母菌活菌数为____________。
解析：(1)依题意可知：筛选分解多氯联苯的菌株时，应将土壤样品稀释(溶解)接种到以多氯联苯为唯一碳源的培养基上。在该培养基中，只有能降解多氯联苯的微生物才能生长，而其他微生物则不能生长，所以从功能上讲，该培养基属于选择培养基。(2)对初步提取到的菌株要进行纯化。图中采用的操作方法是平板划线法。(3)若要测定培养液酵母菌的菌体数，既可在显微镜下用血细胞计数板直接计数，也可选用稀释涂布平板法统计活菌数目。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板进行培养一段时间，其目的是检验培养基平板灭菌是否成功(或倒平板是否感染杂菌或是否彻底灭菌)。(4)将1 mL酵母菌溶液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57、58，据此可得出每升溶液中酵母菌活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×100×103＝5.7×107个/L。
答案：(1)稀释(溶解) 多氯联苯 选择培养基 (2)纯化 平板划线 (3)稀释涂布平板 检验培养基平板灭菌是否成功(倒平板是否感染杂菌或是否彻底灭菌) (4)5.7×107个/L
12．蛋白酶在生物医药和日用化工等生产领域具有重要的经济价值。某同学为筛选产蛋白酶的高产菌株，做了如下实验步骤(配制了下列培养基，在适宜条件下培养)：
步骤
取样
培养基
培养结果
Ⅰ
土壤
样品
葡萄糖、(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O，加水定容
培养液a
Ⅱ
1mL
培养液a
同上
菌落
Ⅲ
挑取
单菌落
细菌培养基
培养液b
(1)为实现筛选目的，步骤Ⅰ
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所使用的培养基配方中，应去除____________并加入高浓度的____________。
(2)为实现目的菌的分离和计数，步骤Ⅱ所使用的培养基中还应加入____________制成平板，采用的接种方法是__________________，实验结果如图A。
(3)步骤Ⅲ应挑取图A中____________处的菌落，本步骤的目的是________________________________________________________________________。
(4)图B是该蛋白酶和其他酶的热稳定性数据，即酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其酶活性。在该蛋白酶的工业化生产过程中，通常需对发酵液在60～70 ℃条件下保温一定时间，其作用是_________________________________________。
解析：(1)培养基中添加特定的成分以促进需要的微生物生长而抑制其他微生物生长，用于进行微生物筛选。根据题意，为筛选产蛋白酶的高产菌株，步骤Ⅰ所使用的培养基配方中，应去除葡萄糖并加入高浓度的蛋白质。(2)为实现目的菌的分离和计数，步骤Ⅱ所使用的培养基中还应加入琼脂(凝固剂)制成平板，采用的接种方法是稀释涂布平板法。(3)图A中a处的菌落透明圈最大，故其菌种分解蛋白质的能力最强，所以步骤Ⅲ应挑取图A中a处的菌落，本步骤的目的是快速增加目的菌的种群数量(即扩大培养)。(4)图B曲线表明，60～70 ℃条件下，蛋白酶的活性很高，而此时其他酶的活性很低，因此在该蛋白酶的工业化生产过程中，通常需对发酵液在60～70 ℃条件下保温一定时间，可大幅度降低发酵液中其他酶的活性。
答案：(1)葡萄糖 蛋白质 (2)琼脂 稀释涂布平板法 (3)a 快速增加目的菌的种群数量(扩大培养)
(4)大幅度降低发酵液中其他酶的活性
13．(四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以__________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加__________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1
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mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为______________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
解析：(1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。
答案：(1)尿素 酚红 红 (2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115
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