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阶段质量检测（二） 微生物的培养与应用
(时间：60分钟；满分：100分)
一、选择题(每小题2.5分，共50分)
1．下列常用的无菌操作中错误的是( )
A．用酒精擦拭双手
B．玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭
C．实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D．用氯气消毒水源
解析：选B 双手可用酒精擦拭来进行消毒；玻璃器皿(吸管、培养皿)需要进行灭菌处理，一般采用干热灭菌法；实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以防止空气中的杂菌污染；水源可用氯气进行消毒。
2．牛奶、吸管、接种环、培养基、空气消毒和灭菌的方式依次是( )
①灼烧灭菌 ②巴氏消毒法 ③干热灭菌 ④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌
A．②③①⑤④ B．②⑤③①④
C．②①③⑤④ D．⑤①③②④
解析：选A 对于不耐高温的液体消毒用巴氏消毒法，如牛奶；吸管为耐高温又要保持干燥的玻璃器皿，采用干热灭菌法；接种环往往采用灼烧灭菌法；培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌比较彻底；空气灭菌常用紫外线照射法。
3．(2018·苏州调研)关于实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作，下列说法正确的是( )
A．配制培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行
B．倒平板时，倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．划线接种时，灼烧接种环后立即进行再次划线
D．划线接种结束后，需将平板倒置后放入培养箱中培养
解析：选D 配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行，倒平板和接种需要在火焰旁进行；倒平板时，应立即盖上培养皿的皿盖；划线接种时，灼烧接种环冷却后进行再次划线。
4．下列有关平板划线操作的叙述，错误的是( )
A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上的菌种
C．划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连
D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
解析：选C 划线时要避免最后一区的划线与第一区的划线相连。
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5．用稀释涂布平板法统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是( )
A．平板上的一个菌落就是一个细菌
B．菌落中的细菌数是固定的
C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同
解析：选C 当稀释倍数适宜时，培养基上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，但也可能由两个或两个以上活菌生长而成，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数低。
6．防止外来杂菌的入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是( )
A．实验室内可以用紫外线或化学药剂进行消毒
B．接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
C．在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染
D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
解析：选B 实验室内可以用紫外线或化学药剂进行消毒；灼烧灭菌应该在酒精灯火焰的外焰部位灼烧；实验室是经过特殊处理的场所，为防止被微生物感染，切不可在实验室中吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手；使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
7．下列有关培养基配制原则的叙述，正确的是( )
A．任何培养基都必须加入碳源、氮源、矿质元素及水
B．碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素
C．微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、氧、温度等条件的影响
D．营养物质的浓度越高越好
解析：选C 培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源；碳源和氮源必须具有一定比例，但碳元素的含量不一定最多，自养型微生物的培养基不需要碳源；微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、氧、温度等条件的影响；营养物质浓度过高会导致微生物失水死亡。
8．下列关于微生物实验室培养的叙述，错误的是( )
A．平板划线法是在培养基上连续划线以纯化菌种的接种方法
B．培养霉菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性
C．培养硝化细菌时可不用在培养基中加有机碳源
D．培养乳酸菌时需要提供无氧的条件
解析：
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选B 平板划线法是在培养基上连续划线以纯化菌种的接种方法；培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性；硝化细菌是自养微生物，可以利用CO2合成有机物，培养时可以不在培养基中加有机碳源；乳酸菌是厌氧微生物，培养时需要提供无氧的条件。
9．用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时( )
①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③都需要在酒精灯火焰旁进行接种 ④都可以用来计数活菌
A．①② B．③④
C．①③ D．②④
解析：选C 平板划线法和稀释涂布平板法都使用固体培养基，①正确；平板划线法采用接种环(针)进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，②错误；进行接种操作时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物污染培养基，③正确；平板划线法一般用于分离菌体而不能计数活菌，④错误。
10．下列有关刚果红染色法的叙述，错误的是( )
A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入
B．刚果红可以在菌落形成后加入
C．刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌
D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌
解析：选C 刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌污染，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入，则刚果红不需要灭菌。
11．下列关于微生物培养和利用的叙述，错误的是( )
A．利用稀释涂布平板法可对微生物进行计数
B．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落
C．在无氮培养基中加入酚红指示剂可用来鉴定尿素分解菌
D．利用刚果红培养基上是否形成透明圈来筛选纤维素分解菌
解析：选C 统计微生物的数目时应选用稀释涂布平板法；菌液经过连续划线，菌液中的菌体越来越少，最后可形成单菌落；鉴定尿素分解菌的培养基不是无氮培养基，其唯一氮源是尿素，尿素分解菌分解尿素形成了氨，氨会使培养基的碱性增强，可用酚红试剂鉴定；当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
12．如表所示为某微生物培养基的配方。下列叙述错误的是( )
成分
NaNO3
K2HPO4
KCl
MgSO4·7H2O
FeSO4
(CH2O)
H2O
青霉素
含量
3 g
1 g
0.5 g
0.5 g
0.01 g
30 g
1 000 mL
0.1万单位
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A.此培养基属于液体培养基，其中的碳源是(CH2O)
B．配制培养基时，溶化后分装前，必须要进行的是调整pH和灭菌
C．接种时应在酒精灯火焰附近操作
D．若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去青霉素，加入的是纤维素粉
解析：选D 此培养基中没有琼脂等凝固剂，属于液体培养基；配制培养基时，在溶化后分装前，必须要进行的是调整pH和灭菌，这是最关键的一个环节；接种时应在酒精灯火焰附近操作；若用该培养基培养纤维素分解菌，应除去的物质是青霉素和(CH2O)，应加入的物质是纤维素粉，提供碳源。
13．在培养细菌的实验过程中，“温度”的控制合理的是( )
A．必须在37 ℃下才能获得单菌落
B．可在28 ℃下培养
C．倒平板时应该让温度降到40 ℃
D．对培养基灭菌时应该是121 ℃
解析：选D 细菌是一大类生物，培养温度因菌种不同而不同，一般在30～37 ℃，应根据具体情况确定培养温度；倒平板时应该让温度降到50 ℃左右；培养基采用高压蒸汽灭菌法灭菌，要在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min。
14．“筛选”是生物学中培育生物新类型常用的手段，下列有关技术过程中不可能筛选成功的是( )
A．在无氮培养基上筛选圆褐固氮菌
B．在不含精氨酸的培养液中筛选能合成精氨酸的杂交细胞
C．用含青霉素的培养基筛选酵母菌和霉菌
D．用不含碳源的培养基筛选根瘤菌
解析：选D 圆褐固氮菌可以固定氮气，所以在无氮培养基上能生长；青霉素可抑制细菌细胞壁的形成，而对酵母菌和霉菌无抑制作用；根瘤菌是异养生物，在不含碳源的培养基上不能生长。
15．下列关于分离尿素分解菌和纤维素分解菌实验的叙述，错误的是( )
A．前者需要尿素为唯一的氮源，后者需要以纤维素为主要的碳源
B．尿素分解菌能产生脲酶，纤维素分解菌能产生纤维素酶
C．两个过程中都需要梯度稀释
D．刚果红染色法也可以用于鉴定尿素分解菌
解析：选D 两种细菌的分离都用到选择培养基，分离尿素分解菌的培养基以尿素为唯一氮源，分离纤维素分解菌的培养基以纤维素为主要碳源；两种细菌能分别产生脲酶和纤维素酶；由于在样品中细菌的浓度较大，所以都要进行梯度稀释；刚果红染色法仅能用于纤维素分解菌的鉴定。
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16.在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数。下面是某培养基的配方中的部分成分：NaNO3、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、H2O。在实验室里进行微生物培养时，进行的接种过程如图所示，则下列说法错误的是( )
A．此实验采用了平板划线法对微生物进行接种
B．每次划线前要对接种环进行灼烧，冷却后从上一区划线末端开始划，首尾区不重叠
C．若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则除去NaNO3成分即可
D．若用于培养纤维素分解菌，应加入纤维素粉
解析：选C 从题意可知，若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则应除去NaNO3，另外还需加入葡萄糖和尿素，分别补充碳源和氮源。
17．下列关于四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，其中正确的一组是( )
硝化细菌
乳酸菌
酵母菌
衣藻
能源
氧化NH3
分解乳酸
固定N2
利用光能
碳源
CO2
糖类
糖类
CO2
氮源
NH3
N2
N2
NO3－
代谢类型
自养需氧型
异养需氧型
异养需氧型
自养需氧型
A.硝化细菌、乳酸菌 B．乳酸菌、酵母菌
C．酵母菌、衣藻 D．硝化细菌、衣藻
解析：选D 乳酸菌是异养厌氧型生物，酵母菌是异养兼性厌氧型生物；乳酸菌和酵母菌的能源物质为糖类，二者不能以N2为氮源。
18．下列说法错误的是( )
A．从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，最主要的实验条件差别是保证无氧环境
B．用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少
C．提取和分离纤维素酶的过程中，为了避免外界酸和碱对酶活性的影响，需向提取液和分离液中添加缓冲溶液
D．若探究纤维素酶活性的最适温度，可设置不同的温度梯度进行空白对照
解析：选D 牛胃是一个无氧的环境，所以分离其中的纤维素分解菌与分离需氧型醋酸菌培养条件有所不同；当两个或多个细菌连在一起时，平板上只观察到一个菌落，所以计数的菌落数比活菌的实际数目偏少；探究酶活性的最适温度可设置一系列的温度梯度相互对照，其他无关变量要相同且适宜。
19．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃
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条件下恒温培养3 d，结果如图所示。从实验结果分析，下列叙述错误的是( )
A．链霉素能阻止结核杆菌的生长
B．链霉素对结核杆菌比对霍乱弧菌更有效
C．链霉素对结核杆菌比对伤寒杆菌更有效
D．链霉素可以用于治疗伤寒
解析：选D 由图可知链霉素对伤寒杆菌没有抑制作用，因此不能用于治疗伤寒。
20．某种细菌菌株需要亮氨酸才能生长，但此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表格中细菌菌株类型，则配制相应选择培养基类型正确的是( )
选项
筛选出不需要亮氨酸的菌株
筛选出抗链霉素的菌株
筛选出不需要亮氨酸的抗链霉素的菌株
A
L＋ S＋
L－ S－
L＋ S－
B
L－ S－
L＋ S＋
L－ S＋
C
L－ S＋
L＋ S＋
L－ S－
D
L＋ S－
L－ S－
L＋ S＋
注：L代表亮氨酸，S代表链霉素；＋代表加入，－代表不加入。
解析：选B 筛选不需要亮氨酸的菌株时培养基中不需要添加亮氨酸，同时也不应该添加链霉素，以免杀死该种细菌；筛选抗链霉素的菌株时需要向培养基中添加链霉素和亮氨酸；筛选不需要亮氨酸且抗链霉素的菌株时需要向培养基中添加链霉素，但不添加亮氨酸。
二、非选择题(除注明外，每空1分，共50分)
21．(10分)某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中活菌数目，培养基配方如表：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
蛋白胨
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
1.0 g
10.0 g
1.0 g
15.0 g
(1)为了成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)，其生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的______和________。根据该培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？________(填“能”或“不能”)，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
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(2)统计每克土壤样品中活菌数目，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的________就能大约推测出样品中活菌数。用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为____________________________________________。
(3)在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2 mL，稀释倍数为105时，每毫升样品中的菌落数为________个。
(4)一同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是________________，为避免此种现象，应对菌液进行________。
解析：(1)尿素分解菌所需要的氮源来源于尿素，碳源来源于培养基中的葡萄糖。据表分析，蛋白胨可以为微生物的生存提供氮源，所以不能用该培养基分离尿素分解菌。(2)固体培养基上的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法可用于微生物的计数，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目能够推测样品中的活菌数。但是当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落，因此用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量多。(3)在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2 mL，稀释倍数为105时，每毫升样品中的菌落数＝50÷0.2×105＝2.5×107(个)。(4)在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是菌液浓度过高，为避免此种现象，应对菌液进行梯度稀释。
答案：(10分)(1)尿素 葡萄糖 不能 培养基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能选择出只分解尿素的微生物 (2)菌落数目 多 当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落 (3)2.5×107 (4)菌液浓度过高 梯度稀释
22．(8分)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于____________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。
(2)步骤③中，实验组的操作是_______________________________________________
___________________________________________________________________。(4分)
(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。
若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。
解析：
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(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。
答案：(8分)(1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂 (2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(4分) (3)污染 不正确
23．(10分)某同学欲利用所学习的微生物培养知识，通过实验来证明痰液中含有细菌，来倡导同学们不要随地吐痰，以下是他进行的实验内容。回答下列问题：
(1)制备供细菌生长的培养基。实验室常用牛肉膏蛋白胨固体培养基，制备该培养基的步骤是：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板，其中灭菌常用的方法是____________，在溶化之后、灭菌之前还需要调________；平板冷凝后，还需要将平板倒置，主要目的是防止__________________________。
(2)琼脂是一种从红藻中提取的多糖，在培养基中常常加入一定量的琼脂，添加琼脂的目的是______________________________________。
(3)为了使实验结果更有说服力，该同学设置了空白对照组和若干实验组，其中对照组的作用是__________________________________。(2分)
(4)微生物接种的方法有稀释涂布平板法和平板划线法，其中平板划线法并不适合用于微生物的计数，其主要原因是______________________________(2分)。某同学利用稀释涂布平板法来统计样品中细菌的数目，他在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为163，则每毫升痰液样品中的细菌数是(所用稀释液的体积为0.2 mL)____________(2分)。
解析：(1)对培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌法；由于平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(2)在培养基中添加琼脂是作为凝固剂。(3)设置对照组的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。(4)平板划线法在起初划线时，微生物菌体仍集中在一起，因此，不能将菌体充分分离开，许多菌落并不是由单个菌体所形成的，因而，该方法不适合用于微生物计数。利用稀释涂布平板法计数每毫升痰液样品中的细菌数为163÷0.2×104＝8.15×106(个)。
答案：(10分)(1)高压蒸汽灭菌法 pH 皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 (2)作为凝固剂，使液体培养基凝固为固体培养基 (3)排除实验组中非测试因素对实验结果的影响(合理即可，2分) (4)不能将菌液中的微生物充分分离开来(2分) 8.15×106个(2分)
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24．(11分)如图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。请分析回答下面的问题：
(1)本实验所需要的培养基为选择培养基，碳源为______________。
(2)实验原理是____________________________________________________________
___________________________________________________________________。(2分)
(3)①→③重复培养的目的是_____________________________________________。
(4)⑤的菌落中大部分是降解________的微生物。
(5)⑥为________________组，⑦为________________组，设置⑥的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(6)⑤→⑥采用________法，接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。(2分)
解析：先用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基，经过富集培养之后，将其涂布到固体平板培养基中分离培养，然后将单菌落接种到液体培养基中，才能得到纯度较高的微生物。
答案：(11分)(1)对羟基苯甲酸 (2)利用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，经富集培养，选出能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物(2分) (3)增大分解对羟基苯甲酸微生物的比例 (4)对羟基苯甲酸 (5)对照 实验 说明通过富集培养的确得到了欲分离的目标微生物 (6)单菌落挑取 接种环在火焰上灼烧灭菌，烧红的接种环应在火焰旁冷却，同时，打开皿盖挑取菌落接种到试管中，并塞好棉塞，再把接种环在火焰上灼烧，杀灭残留物(2分)
25．(11分)酵母菌是一种真菌，与人们的日常生活密切相关，也是现代生物技术研究常用的模式生物，请回答下列有关问题：
(1)土壤中富含各种微生物，将其浸出液接种到特定培养基上，可得到酵母菌，这一过程叫做____________；不同培养基的具体配方不同，但一般都含有______________________________等营养物质。
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(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，在培养酵母菌的过程中，对培养基、接种环所采用的灭菌方法分别是__________________________________。
(3)某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌(可利用空气中的N2作为氮源)和酵母菌混在了一起。请你设计实验，分离得到纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌。
①实验原理：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。(2分)
②材料用具(略)
③主要实验步骤：
第一步：制备两种培养基，一种是________培养基，另一种是________的培养基。分别分成两份，依次标上A、A′和B、B′，备用。
第二步：分别向A、B培养基中接种________。
第三步：接种后，放在恒温箱中培养3～4 d。
第四步：分别从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的菌种，接种到A′和B′培养基中。
第五步：接种后，把A′和B′培养基放入恒温箱中培养3～4 d。
④回答问题：
a．第四、五两个步骤的目的是____________________________________________。
b．在操作中，为保证无杂菌感染，实验中应采用的主要措施有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。(2分)
解析：(1)从自然环境中获得菌种的过程是微生物的分离过程，通常用含有特定物质的选择培养基，该培养基中除含有特殊物质外，一般都包含水、无机盐、碳源、氮源。(2)微生物培养前需对培养基进行高压蒸汽灭菌，而接种环应用火焰灼烧灭菌。(3)圆褐固氮菌为自生固氮菌，可以利用空气中的N2合成自身所需要的含氮有机物。酵母菌为真菌，属于真核生物，不能自己合成有机物，但能在含有青霉素的培养基上生长；青霉素可抑制细菌、放线菌等原核生物细胞壁的合成，也就可以抑制它们的生长，但不会抑制酵母菌的生长，所以需要配制无氮培养基和含青霉素的培养基来筛选这两种微生物，其他条件均应完全相同，如接种混合菌量、培养温度、培养时间等。要获得较纯的菌种，可以进行多次筛选。操作过程要保持无菌，培养基进行高压蒸汽灭菌，接种环进行火焰灼烧灭菌，接种应在酒精灯火焰附近进行。
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答案：(11分)(1)酵母菌的分离 水、无机盐、碳源、氮源
(2)高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌
(3)①圆褐固氮菌是自生固氮菌，能在无氮培养条件下生长繁殖，而酵母菌不可以；青霉素不影响酵母菌等真菌的生长繁殖，但会抑制圆褐固氮菌的生长繁殖(2分)
③无氮 加青霉素 混合菌
④a.获得纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌
b．对培养基进行高压蒸汽灭菌；接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌；接种过程在酒精灯火焰附近进行(2分)
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