现代生物科技专题
[理清——知识联系]
[记清——主干术语]
1．基因工程操作中用到的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。
2．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。
3．质粒是常用的载体，它是一种小型的环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
4．基因工程的基本操作程序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
5．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
7．检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因常用DNA分子杂交技术，检测目的基因是否进行了转录同样是采用分子杂交技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原—抗体杂交技术。
8．蛋白质工程的操作过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
9．植物组织培养的基本过程：
外植体愈伤组织根、芽→植物体。
10．植物体细胞杂交需要用酶解法制备原生质体，所用的酶包括纤维素酶和果胶酶。
11．人工诱导原生质体融合的方法分为物理法和化学法，物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般用聚乙二醇作为诱导剂。
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12．动物细胞培养需满足的条件有充足的营养、适宜的温度和pH、气体及无菌、无毒的环境。
13．单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高，并可以大量制备的优点。
14．诱导动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等。
15．早期胚胎发育的过程：受精卵→卵裂期→桑椹胚→囊胚→原肠胚。
16．胚胎的早期培养所需培养液的成分包括：无机盐、有机盐(两盐)；维生素、激素(两素)；氨基酸、核苷酸(两酸)以及水、血清等。
17．胚胎移植的基本程序：对供、受体的选择和处理→配种或进行人工授精→对胚胎的收集、检查、培养或保存→胚胎移植→移植后的检查。
18．胚胎移植过程中两次使用激素，第一次用孕激素对供、受体进行同期发情处理，第二次用促性腺激素对供体进行超数排卵处理。
19．生态工程建设的目的是遵循自然界物质循环的规律，充分发挥资源的生产潜力，防止环境污染，达到经济效益与生态效益的同步发展。
20．生态工程所遵循的基本原理有物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理、整体性原理及系统学和工程学原理。
[澄清——思维误区]
关注点1 对基因工程中的“载体”与细胞膜上的“载体”区分不清
[澄清] 基因工程中的载体是DNA分子，其功能是携带目的基因进入受体细胞；细胞膜上的载体是蛋白质，其功能是协助某些物质进出细胞。
关注点2 误认为限制酶是一种酶
[澄清] 限制酶是一类酶，而不是一种酶。
关注点3 误认为启动子是起始密码子(RNA)，终止子是终止密码子(RNA)
[澄清] 启动子(DNA片段)≠起始密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)。
关注点4 对蛋白质工程的实质与基因工程的实质认识不清
[澄清] 蛋白质工程是定向改造或生产人类所需蛋白质(可以为自然界中不存在的蛋白质)，而基因工程是定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(一般生产自然界中已存在的蛋白质)。
关注点5 误认为植物组织培养产生新个体属于有性生殖
[澄清] 植物组织培养产生新个体不属于有性生殖，而属于无性繁殖，细胞分裂方式为有丝分裂，包括脱分化和再分化两个阶段。
关注点6 误认为获取细胞产品与人工种子的时期相同
[澄清] 获取细胞产品的时期应为脱分化之后再分化之前的愈伤组织，而制作人工种子需要在再分化后形成的胚状体阶段。
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关注点7 对植物组织培养与动物细胞培养的区别不明
[澄清] (1)植物组织培养和动物细胞培养都存在细胞的培养过程，但植物细胞可以先分裂再分化，而动物细胞只分裂不分化。
(2)植物组织培养可以培养成新个体，动物细胞培养只能培养出一团细胞，不能培养成一个新个体。
关注点8 对受精标志与受精完成的标志认识不清
[澄清] (1)卵子是否受精的标志是第二极体的形成(即在透明带和卵细胞膜间隙观察到两个极体)。
(2)受精完成的标志是雌雄原核融合成含二倍染色体的合子。
关注点9 误认为胚胎发育的过程中，细胞的全能性完全相同
[澄清] 胚胎发育的过程中，细胞的全能性并非完全相同，桑椹胚阶段的细胞具有全能性，囊胚是开始分化的阶段，原肠胚时期已出现高度分化。随着个体的发育，细胞的全能性越来越低。
关注点10 对胚胎移植中的“同种”认识不清
[澄清] 同种动物之间进行胚胎移植易成功。这里的“同种”是指“同一物种”。
关注点11 误认为胚胎分割是有性生殖
[澄清] 胚胎是由受精卵形成的，属于有性生殖； 胚胎分割技术属于无性生殖，也属于克隆。
关注点12 认为不同的生态工程所依据的原理相同
[澄清] 建立不同的生态工程时要依据不同的原理，因地制宜，不能相互照搬。
关注点13 误认为实现生态经济有时可以不遵循生态学的基本原理
[澄清] 实现生态经济一定要遵循生态学的基本原理，如果违背这些原理，就会使生态系统偏离稳态，甚至导致生态系统崩溃。
关注点14 误认为污染物是不能利用的资源
[澄清] 对环境造成危害的污染物，采取一定的措施和技术，就能够进行回收和循环利用，这样不但能够减少环境污染，而且能提高资源的利用率，减少资源的浪费。
关注点15 误认为提高能量利用率＝提高能量传递效率
[澄清] 提高能量的利用率，可通过缩短食物链和能量的多级利用来实现。提高能量的传递效率，需通过提高下一营养级的同化量来实现。
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2个主攻点之(一) 基因工程和克隆技术
一、基因工程
1．基因工程的基本工具(填图)
2．基因工程的基本操作程序(填空)
(1)目的基因的获取途径：
方法
具体操作
直接
分离
从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取
人
工
合
成
化学
方法
已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板
逆转
录法
以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成
PCR
技术
扩增
①原理：DNA复制
②条件：模板DNA、引物、脱氧核苷酸、热稳定的DNA聚合酶
(2)基因表达载体——重组质粒的构建：
①表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。
②启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录
50
的位点。
(3)将目的基因导入受体细胞：
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用
方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体
细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
(4)目的基因的检测与鉴定：
①导入检测：DNA分子杂交技术(使用DNA探针)。
②表达检测
③个体生物学水平鉴定，如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。
3．蛋白质工程(填空)
二、克隆技术
1．植物组织培养技术(填图)
2．动物细胞培养(填图)
3．动物体细胞克隆技术(填图)
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4．动物细胞融合与单克隆抗体(填图)
考向(一) 基因工程的操作工具、原理及过程
[真题导向]
1．(2014·江苏高考，多选)下列关于基因工程技术的叙述，错误的是( )
A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列
B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应
C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
解析：选ABC 限制性核酸内切酶大多特异性识别6个核苷酸序列，但并非都只识别6个核苷酸序列；PCR中耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用；载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，而不是抗生素合成基因；目的基因导入受体细胞后不一定都能正常表达。
2．(2017·江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR
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扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。
解析：(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火(复性)，步骤3为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。
答案：(1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板 GC含量高 (5)②③
(1)原理：利用DNA双链复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。
(2)条件及作用：
条件
作用
在一定的缓冲液中进行
提供相对稳定的pH环境
四种脱氧核苷酸
作为合成DNA子链的原料
DNA母链
作为DNA复制的模板
Taq DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3′
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端开始连接脱氧核苷酸
温度
控制
90～95 ℃
变性：使DNA片段双链解开
55～60 ℃
复性：使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合
70～75 ℃
延伸：Taq DNA聚合酶催化子链合成
(3)解题规律总结：
①模型图示：
②规律总结：
循环数
第一轮
第二轮
第三轮
第n轮
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物的DNA分子数
2
4
8
2n
含引物A(或B)的DNA分子
1＝21－1
3＝22－1
7＝23－1
2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数
0＝21－2
2＝22－2
6＝23－2
2n－2
共消耗的引物数量
2＝22－2
6＝23－2
14＝24－2
2n＋1－2
含与脱氧核苷酸链等长的DNA分子数
0＝21－2
0＝22－4
2＝23－6
2n－2n
DNA分子种类
2
4
5
5
3．(2016·江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
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限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点
图1
图2
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_________________________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________________________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2＋处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式,结合电泳技术来分析处理。DNA的两条链是反向平行的,在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链,
50
因此应选择引物甲和引物丙。(3)因为BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同,所以可以被DNA连接酶连接,连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(4)由图可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3A Ⅰ的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有三种情况，都产生一种大小的DNA片段，即大小均为a＋b＋c；考虑切2个切割位点，则会产生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。
答案：(1)BclⅠ和HindⅢ DNA连接 感受 (2)四环素 引物甲和引物丙
(3) 都不能 (4)7
(1)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。限制酶是一类酶，不是一种酶。限制酶的化学成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(2)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。
(3)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键(不是氢键), 只是一个切开，一个连接。限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(4)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
(5)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
[过关练习]
1.将经过扩增的DNA和质粒用相同的限制酶进行如右图所示的切割，电泳得到纯净的B片段和D片段，将两种片段置于适宜的缓冲液中用DNA连接酶处理。如果只考虑两个片段的环状连接，则能形成不同核苷酸序列的环状DNA的种类是( )
A．6种 B．3种
C．2种 D．1种
解析：选A 只考虑两个片段的环状连接，能形成的环状DNA有B片段与B
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片段同向连接的、B片段与B片段反向连接的、D片段与D片段同向连接的、D片段与D片段反向连接的、B片段与D片段同向连接的及B片段与D片段反向连接的，共6种。
2．(2018·徐州模拟)下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( )
A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同
B．PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关
C．在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体
D．质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上才能表达
解析：选C 不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同；PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的；在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更
高；质粒本身是DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到受体细胞的DNA上并表达。
3．下图为绿色荧光小鼠制备流程图，Gfp是绿色荧光蛋白基因。请据图回答问题：
(1)据图分析可推知，载体上的Neo为________基因，其表达产物可与________发挥作用而最终将____________的胚胎干细胞筛选出来。
(2)完成过程①需要的工具酶是____________，完成过程②常用的方法是___________，完成过程⑤后，胚胎干细胞应与囊胚中的________部位相结合。
(3)进行过程⑥之前，要对代孕母鼠用某种激素处理，目的是_____________________。
(4)胚胎干细胞的培养装置应置于________________的气体环境中，以保证培养环境pH的相对稳定。
解析：(1)根据题意知，Gfp是目的基因，所以载体上的Neo为标记基因。根据题图可知，其表达产物可与G418发挥作用而最终将导入目的基因的胚胎干细胞筛选出来。(2)完成过程①需要的工具酶是DNA连接酶，完成过程②常用的方法是显微注射法，完成过程⑤后，胚胎干细胞应与囊胚中的内细胞团部位相结合。(3)过程⑥是胚胎移植，进行胚胎移植之前，要对代孕母鼠进行同期发情处理。(4)细胞培养液中通入含5%的CO2的空气可以保证培养环境pH的相对稳定。
答案：(1)标记 G418 导入目的基因 (2)DNA连接酶 显微注射法 内细胞团 (3)使其同期发情 (4)含一定量(5%)的CO2
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考向(二) 综合考查基因工程的应用
[真题导向]
1．(2018·江苏高考)为生产具有特定性能的α淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_______________
________________________________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液
50 mmol/L
Na2HPO4KH2PO4
50 mmol/L
TrisHCl
50 mmol/L
GlyNaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
50
酶相对
活性(%)
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8
根据上述实验结果，初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为________________________
___________________________________________________。
解析：(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl。
答案：(1)基因组DNA (2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 (3)② ⑥ (4)8 13
(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl
2．(2015·江苏高考)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。下图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题：
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(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是________。
(2)图1中启动子是________酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是_____________________________________________________。
(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有____________________。
(4)β半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于________________________________________________________。
(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且β半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为_________________________
_____________________________________________________________________________。
(6)根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是________，理由是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)基因表达载体中应具有启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点。(2)启动子是转录过程中RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达。图中的氨苄青霉素抗性基因充当了标记基因，可用含有氨苄青霉素的培养基筛选含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体时，需要用同种限制酶分别切割目的基因和载体，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接。(4)胰岛素肽链上具有蛋白酶的切割位点，会导致胰岛素被菌体内的蛋白酶降解，而通过融合表达将切割位点隐藏在内部可防止胰岛素的A、B链被菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，并结合β半乳糖苷酶被切成多个肽段，获得了完整的胰岛素A链、B链这一信息，可以推测β半乳糖苷酶中必然含有多个甲硫氨酸，胰岛素A链、B链不含甲硫氨酸。(6)每一条肽链的两个末端分别含有一个氨基和一个羧基，某些氨基酸的R基中也含有氨基，因此含两条肽链的胰岛素中至少含有2个游离的氨基。
答案：(1)终止子 (2)RNA聚合 作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来 (3)限制酶和DNA连接酶 (4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解 (5)β半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸 (6)至少2个 两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基
(1)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
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(2)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
(3)植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
(4)基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)。
(5)基因表达载体的构建是最核心的一步，在体外进行。个体水平上的检测和鉴定是衡量基因工程操作是否成功的最简单最有效的方法。
[过关练习]
1．甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加__________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
解析：(1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术，鉴定筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA
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聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。
答案：(1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总RNA (3)非天然氨基酸(Uaa) D
2．(2019届高三·常州四校调研)如图为利用奶牛的乳汁生产胰岛素的流程图。回答下列问题：
(1)质粒载体的基本组成单位是________________，质粒载体作为基因工程的工具，应具备的条件有__________________________________________________________(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除了满足上述基本条件外，还需要具有启动子和终止子。
(2)据图分折，最好选用________________(填限制酶名称)分别切割含目的基因的DNA分子和质粒分子。当胰岛素基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________。
(3)要使胰岛素基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体，而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是____________________________________________________。将重组质粒导入受精卵的方法是______________；经检测，胰岛素基因已导入受体细胞的基因组中，但转基因奶牛通过乳腺生物反应器未生产出胰岛素，根据中心法则分析，其原因可能是________________________________________________________________________。
(4)通过乳腺生物反应器生产胰岛素，需提前对形成的受精卵进行筛选，保留含性染色体组成为___________(填“XX”或“XY”)的类型。
解析：(1)质粒载体是小型环状DNA，其基本组成单位是脱氧核苷酸，质粒载体作为基因工程的工具，应具备的条件有具有自我复制的能力、有一个至多个限制酶切割位点、含有标记基因。作为基因表达载体，除了满足上述基本条件外，还需要具有启动子和终止子。(2)据图分折，最好选用SmaⅠ、PstⅠ分别切割含目的基因的DNA分子和质粒分子。当胰岛素基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(3)要使胰岛素基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体，而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点，无表达所需的启动子。将重组质粒导入受精卵的方法是显微注射法；经检测，胰岛素基因已导入受体细胞的基因组中，但转基因奶牛通过乳腺生物反应器未生产出胰岛素，根据中心法则分析,其原因可能是胰岛素基因的转录或翻译异常。(4)通过乳腺生物反应器生产胰岛素，需提前对形成的受精卵进行筛选，要选雌性的受精卵，故保留含性染色体组成为XX的类型。
答案：(1)脱氧核苷酸 具有自我复制的能力、有一个至多个限制酶切割位点、含有标记基因 (2)SmaⅠ、PstⅠ 磷酸二酯键 (3)
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目的基因无复制原点和无表达所需的启动子 显微注射法 (目的基因的)转录或翻译异常 (4)XX
考向(三) 克隆技术及应用
[真题导向]
1．(2018·江苏高考)花药离体培养是重要的育种手段。下图是某二倍体植物花药育种过程的示意图，下列叙述正确的是( )
A．为了防止微生物污染，过程①所用的花药需在70%乙醇中浸泡30 min
B．过程②的培养基中需添加较高浓度的细胞分裂素以利于根的分化
C．过程③逐步分化的植株中可筛选获得纯合的二倍体
D．过程④应将炼苗后的植株移栽到含有蔗糖和多种植物激素的基质上
解析：选C 通常将花药用体积分数为70%的酒精浸泡30 s，立即取出，在无菌水中清洗；过程②为脱分化形成愈伤组织的过程，所用培养基中细胞分裂素和生长素的比例应适中；过程③为再分化，因用秋水仙素处理了由花药形成的愈伤组织细胞，故能筛选获得纯合的二倍体；过程④应将炼苗后的植株移栽到土壤中。
2.(2018·江苏高考，多选)如图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是( )
A．若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去分化再诱导融合
B．a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现
C．c细胞的形成与a、b细胞膜的流动性都有关
D．c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因
解析：选BC 若a细胞和b细胞是植物细胞，应先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，然后再诱导融合；a细胞和b细胞之间的融合需要借助物理、化学等方法处理后才能实现；细胞的融合与细胞膜的流动性有关；融合后的c细胞中的基因进行选择性表达，只能表达a、b两细胞的部分基因。
3．(2014·江苏高考)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。 请回答下列问题：
(1)外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为___________________________________。
(2)在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如上图所示。细胞干重在
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12 d后下降的原因有_________________________；培养液中蔗糖的作用是_____________、______________。
(3)多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经______________处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常用纤维素酶和________酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞(2n)经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是______________________________________________、
____________________________。
(4)为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。 下列说法正确的有____________(填序号)。
①选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋
②必须在光照条件下培养
③培养过程中需通空气
④固定化后植物细胞生长会变慢
解析：(1)外植体是植物体离体的组织、器官或细胞，诱导形成愈伤组织的过程称为脱分化。(2)在培养过程中，蔗糖除为细胞提供能源，还具有调节渗透压的作用。随着蔗糖的消耗，营养供应减少，同时，细胞代谢产物、废物增加，使pH降低(偏酸)，不利于细胞生长。(3)秋水仙素或低温处理都可诱导细胞染色体数目加倍。纤维素酶和果胶酶处理细胞壁，可以使细胞之间易于分离(解离)。(4)获得植物次生代谢产物应选用生长旺盛的愈伤组织；愈伤组织细胞进行有氧呼吸，故需要通气；愈伤组织没有叶绿体，产生次生代谢产物的过程不需要光照；固定化细胞所用包埋材料会影响营养物质和氧气的扩散，使固定化后的植物细胞生长速度变慢。
答案：(1)脱分化 (2)蔗糖浓度下降，pH降低 提供能源 调节渗透压 (3)秋水仙素(低温) 果胶 经加倍到4n的细胞处于有丝分裂后期 经加倍到8n的细胞处于有丝分裂中期 (4)①③④
(1)植物细胞A和植物细胞B杂交获得的杂种细胞的类型有三种：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要进行筛选。
(2)杂种细胞形成的标志：生成新的细胞壁。
(3)杂种植株遗传物质的变化：杂种植株的变异类型属于染色体变异，杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，杂种植株属于异源多倍体。
(4)植物组织培养时植物激素和光照的使用：
①植物激素的使用：脱分化阶段先使用生长素，后使用细胞分裂素，以促进细胞的分裂；再分化阶段需要调节生长素与细胞分裂素的比例，当生长素比例低时，利于芽的形成，生长素比例较高时，可促进根的形成。
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②光照的使用：脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。
(5)利用植物组织培养生产细胞产物时，有时只需将外植体培养到愈伤组织，从愈伤组织中获取产物。
[过关练习]
1．下列有关细胞工程的叙述，正确的是( )
A．PEG是促细胞融合剂，可直接诱导植物细胞融合
B．用原生质体制备人工种子，要防止细胞破裂
C．骨髓瘤细胞经免疫处理，可直接获得单克隆抗体
D．核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供卵母体
解析：选D PEG是促细胞融合剂，能诱导植物原生质体融合，融合前需先用酶解法去除植物细胞的细胞壁；制备人工种子应该用组织培养形成的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，而不是原生质体；单克隆抗体是杂交瘤细胞产生的，骨髓瘤细胞不能分泌抗体；利用核移植技术克隆动物时，是将体细胞的细胞核移入去除细胞核的卵母细胞中，所以克隆动物的线粒体DNA来自供卵母体。
2．设计植物体细胞杂交实验时，如果期望获得性状优良的作物新品种，通常不需要考虑的是( )
A．选择具有优良性状的亲本
B．选择能去除细胞壁的酶
C．亲本间的生殖隔离
D．培养基中生长素和细胞分裂素的浓度及比例
解析：选C 设计植物体细胞杂交的目的是期望获得性状优良的作物新品种，所以需要选择具有优良性状的亲本；由于细胞壁的存在会阻碍细胞的融合，所以要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁；由于植物体细胞杂交可以打破物种间的界限，故不需要考虑亲本间的生殖隔离；培养基中生长素和细胞分裂素的浓度及比例会影响细胞的脱分化和再分化。
3．胰岛B细胞移植是一种有效治疗糖尿病的方法。利用小鼠再生胰腺提取物(RPE) 可定向诱导人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化成胰岛B细胞。请回答下列问题：
(1)取人羊膜组织刮除血块、上皮细胞，冲洗后剪碎，然后用________________酶处理，最终制成hAMSCs 悬液。将细胞悬液放入培养瓶中进行原代培养，当细胞贴壁生长到一定阶段时，出现________________现象，此时细胞停止分裂增殖，这时需要将细胞进行相关处理，然后进行传代培养。
(2)取传至第 3 代的hAMSCs放入细胞培养板，同时加入RPE 进行诱导分化培养。该代hAMSCs 能保持细胞正常的________________。诱导分化培养15天后，提取细胞的______________，用胰岛素基因探针进行分子杂交，可初步检测 hAMSCs 是否分化成胰岛 B
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细胞。(3)用人的杂交瘤细胞来生产人源单克隆抗体难以成功，因此单克隆抗体大都来自鼠源。但鼠源单抗在人体内使用时，会产生较强的免疫原性，为解决这一问题，发明了嵌合抗体，大致过程如图所示：
嵌合抗体能降低鼠源抗体的免疫原性，从图中可以推测，免疫原性的产生主要与抗体的________(填“V区”或“C区”)有关，嵌合抗体的生产属于_______________工程范畴。
解析：(1)用胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)处理人羊膜组织，可制成hAMSCs悬液。将细胞悬液放入培养瓶中进行原代培养，当细胞贴壁生长到一定阶段时，会出现接触抑制现象。(2)10代以内的细胞可以保持正常的二倍体核型，因此传至第 3 代的hAMSCs能保持细胞正常的(二倍体)核型。细胞分化的实质是基因的选择性表达，因此要检测 hAMSCs 是否分化成胰岛 B 细胞，可提取细胞的RNA(或mRNA)，用胰岛素基因探针进行分子杂交。(3)从图中可以推测，免疫原性的产生主要与抗体的C区有关。嵌合抗体的生产属于蛋白质工程范畴。
答案：(1)胰蛋白(或胶原蛋白) 接触抑制 (2)(二倍体)核型 RNA (3)C区 蛋白质
一、选择题
1．(2019届高三·南京六校联考)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，
对降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是( )
解析：选C 根据电泳图可知KpnⅠ 切割只得到1种DNA片段，判断该DNA分子是环状，且该DNA分子上只有1个KpnⅠ 切点。EcoRⅠ 切割得到2种DNA片段，说明该DNA
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分子上有两个EcoRⅠ 切点。据此分析选项中的酶切图谱，只有C项符合。
2．中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境。下列说法错误的是( )
A．该工程可以定向改变蛋白质分子的结构
B．改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的
C．改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种
D．改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
解析：选D 蛋白质工程通过对基因进行人工合成或修饰，最终定向改变蛋白质分子的结构；改造后的中华鲟遗传物质变化不大，和现有中华鲟不存在生殖隔离，仍是同一物种；改造后的中华鲟含有控制新蛋白质合成的基因，所以后代具有改造的蛋白质。
3．(2018·江苏六市二模)农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的运载体，下列相关叙述正确的是( )
A．Ti质粒是能够自主复制的单链DNA
B．Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接
C．重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞
D．Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上
解析：选B Ti质粒是能够自主复制的环形双链DNA分子，其分子内部的磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接。重组Ti质粒的受体细胞可以是植物愈伤组织细胞，也可以是其他的植物细胞，如植物的受精卵细胞。农杆菌有Ti质粒，Ti质粒上有一段TDNA，目的基因需插入Ti质粒上的TDNA中形成重组质粒载体，再导入农杆菌，然后让含重组质粒载体的农杆菌侵染植物，只有Ti质粒上的TDNA片段(内有目的基因)而不是Ti质粒上的全部基因整合到受体细胞染色体上。
4．下列关于人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( )
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均始于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可以将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．表达载体中的启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
解析：选C 胰岛素基因在人体肝细胞中不表达，所以从肝细胞中不能提取到胰岛素基因转录成的mRNA；基因的表达始于启动子，基因的复制始于复制原点；抗生素抗性基因作为标记基因，可以将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来；启动子是转录的起点，终止密码子是翻译的终点。
5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( )
A．动物细胞培养过程中往往使用液体培养基
B．动物细胞培养的目的是为了培养动物个体
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C．在培养过程中通常要通入5%的CO2刺激细胞呼吸
D．动物细胞培养过程中可用胃蛋白酶将动物组织分散成单个细胞
解析：选A 动物细胞培养的目的是为了获得细胞群或细胞产物；动物细胞培养过程中通常要通入5%的CO2的作用是维持培养液的pH；动物细胞培养过程中用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将动物组织分散成单个细胞。
6．植物细胞工程作为一门新兴的生物技术，被广泛应用于社会生产，下列说法错误的是( )
A．人工种子是用人工薄膜为种皮包被植物愈伤组织形成的
B．植物微型繁殖运用了植物组织培养技术，可快速繁殖良种植物
C．作物脱毒常选取植物的茎尖，因为该处病毒较少或无病毒
D．植物细胞融合中常用的融合手段有离心、振动、电激和PEG法
解析：选A 人工种子常使用人工薄膜作为种皮包被胚状体。
7．(2018·江苏四校联考)下列关于植物组织培养及其应用的叙述，正确的是( )
A．离体的植物组织、器官必须经过灭菌才能接种到组织培养基中
B．以植物芽尖为材料通过组织培养可以获得抗毒新品种
C．生长素、细胞分裂素的调节作用在组织培养中非常重要
D．以人工膜包裹植物愈伤组织和营养物质可制得人工种子
解析：选C 离体的植物组织、器官必须经过消毒(灭菌会杀死植物组织和器官)才能接种到组织培养基中；以芽尖为材料通过组织培养可以获得脱毒苗，但不属于新品种，抗病毒的新品种需通过转基因技术获得；生长素、细胞分裂素调节作用在组织培养中非常重要；以人工膜包裹胚状体和营养物质可制得人工种子。
8．下列关于动物细胞培养技术的叙述，错误的是( )
A．生物组织经胰蛋白酶消化处理制成细胞悬液，再培养可获得单层细胞
B．研究中使用的细胞通常培养至10代以内，以保持正常的二倍体核型
C．为防止杂菌污染，生物组织、培养液及培养用具需要进行灭菌处理
D．动物细胞培养是制备单克隆抗体、细胞核移植、胚胎工程等技术的基础
解析：选C 生物组织灭菌处理后会死亡，无法培养，生物组织通常做消毒处理。
9．(2018·扬州一模，多选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列有关叙述正确的是( )
A．过程①需使用逆转录酶
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B．过程②利用PCR扩增CarE基因需使用解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
解析：选AD 利用PCR扩增基因时，通过高温使DNA解旋，不需要解旋酶，但需要耐高温的DNA聚合酶；用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。
10．(多选)超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，具有延缓衰老的功效。下图为培养转SOD基因胡萝卜新品种的过程，相关叙述正确的是( )
A．过程①通常采用显微注射法将携带SOD基因的Ti质粒导入细胞
B．过程②③除培养基中所含激素比例不同外，其他条件完全相同
C．将愈伤组织分散成单个细胞，通过细胞培养也可能获得大量SOD
D．该育种方式获得的转基因胡萝卜自交后代可能会出现性状分离
解析：选CD 植物基因工程中，目的基因导入受体细胞的常用方法是农杆菌转化法；在植物组织培养过程中，脱分化(②)和再分化(③)阶段使用的培养基除植物激素的比例不同外，营养物质的含量也不完全相同，并且脱分化阶段不需要光照，再分化阶段需要光照。
二、非选择题
11．如图是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病(基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素)的过程图解，请据图回答下列问题：
(1)图中①结构表示________，选择____________(时期)的卵母细胞去核后作为受体细胞构建重组细胞A。
(2)②所示的细胞是________________，将健康胰岛素基因导入②中的常用方法是________________。
(3)在培养液中加入______________可诱导重组细胞B定向分化形成具有正常胰岛B细胞功能的胰岛样细胞，其根本原因是_______________________________________________。
(4)图示方法与一般的异体移植相比最大的优点是______________________________。
解析：(1)分析图解可以看出，重组细胞A的形成利用的是体细胞核移植技术，故图中①结构表示细胞核，应选择处于MⅡ中期的卵母细胞去核后作为受体细胞构建重组细胞A。(2)
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②是囊胚中的内细胞团细胞或胚胎干细胞，具有发育的全能性，将含目的基因表达载体导入动物细胞常用的方法是显微注射技术。(3)重组细胞B在一定的分化诱导因子的定向诱导作用下，可以定向分化形成具有正常胰岛B细胞功能的胰岛样细胞，其根本原因是基因的选择性表达。(4)图示方法属于基因治疗，由于输入患者体内的细胞是由患者自身的细胞分化而来，所以与一般的异体移植相比，该方法最大的优点是不会发生免疫排斥反应。
答案：(1)细胞核 MⅡ中期(减数第二次分裂中期) (2)内细胞团细胞(或胚胎干细胞) 显微注射技术
(3)分化诱导因子 基因的选择性表达 (4)没有免疫排斥反应
12.科学家发现细菌细胞中存在清除入侵病毒DNA的功能系统(图1)，并发明了CRISPR/Cas9基因编辑技术，目前已成为生物科学领域最热门的基因操作技术。图2 是科研人员运用CRISPR/Cas9基因编辑技术(其中表达载体1的作用是在受体细胞中控制合成CRISPR复合体，表达载体2可以与相应DNA的同源区进行互换、重组)，成功地将基因A精确导入到绒山羊细胞内的甲、乙两个基因之间，并和绿色荧光蛋白基因一起表达的过程示意图。请回答下列问题：
(1)由图1可知，CRISPR复合体中crRNA的主要功能是__________________________，而Cas9蛋白催化断裂的化学键位于________________之间。细菌的这种清除能力的生理意义是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)结合对图1的理解，图2中表达载体1首先要表达出含有__________________________序列的crRNA和Cas9蛋白，以结合形成CRISPR复合体。
(3)根据图2，基因表达载体2上需要加入：①基因甲片段、②基因乙片段、③基因A、④绿色荧光蛋白基因等四种DNA片段，这4种片段在载体上的正确排列顺序应是_______(用序号代表相应片段)。在形成重组DNA时需要___________酶参与催化表达载体2与绒山羊DNA的连接。
(4)实验室一般会将重组DNA导入山羊的胚胎干细胞中，以培育、筛选出转基因山羊，选择胚胎干细胞作为受体细胞的主要依据是_______________________________________。
(5)与传统的基因工程相比较，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物的明显优点是________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________。
解析：(1)由图1可知，crRNA是由DNA的特定区段转录形成的，由此可推知，CRISPR复合体中crRNA的主要功能是识别DNA分子上的特定核苷酸序列；CRISPR复合体能催化水解噬菌体DNA，由此可推知CRISPR复合体中的Cas9蛋白催化断裂的化学键位于磷酸和脱氧核糖之间；细菌的这种清除能力可防止外源基因插入并表达，保证了细菌遗传性状的稳定。(2)据图2可知，表达载体1表达出的CRISPR复合体可以切割基因甲和基因乙之间的DNA片段，所以结合对图1的理解，可推知图2中表达载体1首先要表达出含有基因甲与基因乙之间部分核苷酸序列的crRNA和Cas9蛋白，以结合形成CRISPR复合体。(3)根据图2重组DNA中各基因片段的排列顺序，可推知这4种片段在基因表达载体2上的正确排列顺序应是①③④②；在形成重组DNA时需要DNA连接酶参与催化表达载体2与绒山羊DNA的连接。(4)要培育、筛选出转基因山羊，选择胚胎干细胞作为受体细胞的主要依据是胚胎干细胞具有发育的全能性。(5)与传统的基因工程相比较，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物的明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
答案：(1)识别DNA分子上的特定核苷酸序列 磷酸和脱氧核糖 防止外源基因插入并表达，保证了细菌遗传性状的稳定 (2)基因甲与基因乙之间部分核苷酸 (3)①③④② DNA连接 (4)胚胎干细胞具有发育的全能性 (5)避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题
13．RTPCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示：
(1)过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、_________________、____________和引物A等。
(2)进行过程Ⅱ前首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是_________________
_______________________________________________________，该反应体系中所用的Taq酶至少应能耐受__________℃高温。
(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要________个引物B。
(4)利用RTPCR技术获取的目的基因______________(填“能”或“不能”)在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是________________________________________________________________________。
(5)RTPCR过程中主要借助对________的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
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解析：(1)过程Ⅰ是由mRNA形成cDNA的过程,示逆转录,要加入缓冲液、原料、RNA提取物、逆转录酶和引物A等。(2)进行过程Ⅱ前首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是让逆转录酶变性失活、使mRNAcDNA杂合双链解开，该反应体系中所用的Taq酶至少应能耐受95 ℃高温。(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要2n－1个引物B。(4)利用RTPCR技术获取的目的基因能在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测。(5)RTPCR过程中主要借助对温度的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
答案：(1)RNA提取物 逆转录酶 (2)让逆转录酶变性失活、使mRNAcDNA杂合双链解开(答出一点即可) 95 (3)2n－1 (4)能 增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测 (5)温度
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2个主攻点之(二) 胚胎工程、生物技术的安全性和伦理问题与生态工程
1．受精作用和早期胚胎发育过程(据图填空)
(1)受精条件：精子需经过①获能过程，对于啮齿类动物的精子，一般采用培养法；卵母细胞需发育至MⅡ中期才能参与受精过程。
(2)受精过程：防止多精入卵的两道屏障是透明带反应和卵细胞膜反应。
(3)早期胚胎发育过程：③④过程的核质比逐渐增大，孵化发生在囊胚后期，即⑤过程(填发生时期及数字代号)。细胞开始出现分化的时期是囊胚时期。
(4)胚胎的早期培养：
①培养液成分中的“两素”“两酸”分别指维生素与激素、氨基酸与核苷酸。
②当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植，或冷冻保存。
2．胚胎工程的操作流程(填图)
3．生物技术的安全性、伦理问题
(1)对转基因生物安全性的争论：在食物安全、生物安全、环境安全三个方面存在激烈的争论。
(2)治疗性克隆和生殖性克隆的区别和联系：(填表)
类型
项目
治疗性克隆
生殖性克隆
区
别
目的
从胚胎中取出干细胞用于医学研究和治疗
用于生育，获得人的复制品
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水平
细胞水平
个体水平
联系
都属于无性生殖；产生新组织或新个体，遗传信息相同
4．生态学实例与生态工程原理(填表)
生态学实例
生态工程原理
单一人工林比天然混合林稳定性低，易爆发虫害
物种多样性原理
对草原确定合理的载畜量，不能过度放牧
协调与平衡原理
引种考虑适应环境
协调与平衡原理
林业生态工程建设，既考虑种树又考虑生活问题
整体性原理
无废弃物农业
物质循环再生原理
在人工林中增加植被的层次
物种多样性原理
考向(一) 体外受精及早期胚胎培养
[真题导向]
1．(2017·江苏高考)下列关于小鼠体外受精及胚胎发育的叙述，错误的是( )
A．精子在获能液中于37 ℃、5%CO2条件下培养的目的是使精子获能
B．小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射相关激素有促进超数排卵的作用
C．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，因此发育成的个体没有形态学差异
D．注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育
解析：选C 精子在获能液中于适宜条件下培养可以使精子获能；小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射促性腺激素促进其超数排卵；分割的胚胎细胞虽有相同的遗传物质，但由于生物的性状还受环境等因素的影响，故发育成的个体会存在形态学差异；胚胎干细胞可以发育成组织、器官，注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育。
2．(2016·江苏高考)印度沙漠猫是一种珍稀猫科动物，通过胚胎工程技术，可以让家猫代孕而繁育，主要步骤如图所示。下列相关叙述正确的是( )
A．步骤甲、乙分别是指精子获能、胚胎分割
B．诱导超数排卵所注射的激素只能作用于特定细胞
C．受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于培养液
D．步骤甲使用的培养液和早期胚胎培养液成分基本相同
解析：选B
50
步骤甲为体外受精，步骤乙为胚胎移植；诱导超数排卵所用的激素是促性腺激素，只作用于性腺细胞；受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于卵细胞中的卵黄；步骤甲体外受精使用的是获能溶液或专用的受精溶液，与早期胚胎培养液成分有较大差异。
3．(2014·江苏高考)杜泊羊以其生长速度快、肉质好等优点，被称为“钻石级”肉用绵羊。科研工作者通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如图所示，相关叙述正确的是( )
A．为了获得更多的卵母细胞，需用雌激素对雌性杜泊羊进行处理
B．从卵巢中采集的卵母细胞可直接与获能的精子进行体外受精
C．为避免代孕绵羊对植入胚胎产生排斥反应，应注射免疫抑制剂
D．为了进一步扩大繁殖规模，可通过胚胎分割技术获得同卵双胎
解析：选D 超数排卵应使用促性腺激素而不是雌激素；从卵巢中采集的卵母细胞需培养至成熟后才能与获能的精子进行体外受精；受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，故不需注射免疫抑制剂；为了进一步扩大繁殖规模，可通过胚胎分割技术获得同卵双胎或多胎。
项目
克隆动物
试管动物
转基因动物
概念
用核移植的方法获得的动物
用体外受精的方法获得的动物
由被转入了目的基因的受精卵发育成的动物
技术
核移植
体外受精
DNA重组技术
生殖方式
无性繁殖
有性生殖
有性生殖或保持原生殖方式
遗传特性
主要与供核个体相同
具备双亲的遗传性状
具备原受精卵及被转入的目的基因两方的遗传特性
相同点
三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑椹胚或囊胚期的胚胎
[过关练习]
1．(2018·南通调研)下列关于高等哺乳动物受精过程的叙述，正确的是( )
A．获能的精子穿越透明带的同时释放顶体酶水解卵细胞膜
B．透明带反应和卵细胞膜反应是阻止多精入卵的两道屏障
C．精子被卵细胞膜表面的微绒毛抱合后立即发生卵细胞膜反应
D．精子入卵后立即与卵细胞核发生融合并马上开始有丝分裂
解析：选B
50
在受精过程中，获能的精子头部的顶体首先释放顶体酶，发生顶体反应，然后精子穿越放射冠和透明带；透明带反应和卵细胞膜反应是阻止多精入卵的两道屏障；精子与卵细胞膜接触后，被其表面大量的微绒毛抱合，随后精子外膜与卵细胞膜发生融合，精子的尾脱落，细胞核进入卵细胞，所以精子入卵后，卵细胞随即发生卵细胞膜反应；精子入卵后，核膜破裂形成雄原核，再与雌原核结合。
2．(2018·徐州考前模拟)如图是克隆牛的操作流程示意图，下列有关叙述正确的是( )
A．卵母细胞属于初级卵母细胞
B．犊牛的质基因只来自受体
C．细胞①、②的培养与早期胚胎的培养都需加入动物血清
D．早期胚胎发育到囊胚期时，需要取内细胞团部分细胞做DNA分析
解析：选C 卵母细胞属于初级卵母细胞或次级卵母细胞；犊牛的质基因只来自供体母牛；动物细胞培养与早期胚胎的培养都需要加入血清或血浆等天然物质；早期胚胎发育到囊胚期时，需要取滋养层细胞做DNA分析，进行性别鉴定。
3．为了提高牛奶产量、增加经济效益，某农场应用现代生物技术培育高产奶牛，流程如下图。
请据图回答下列问题：
(1)在过程①之前，需要对供体和受体母牛进行___________________处理；供体良种公牛的精子需获能后才能完成受精作用，若在体外可将精子放在一定浓度的____________中使精子获能。
(2)受精时，精子需顶体内________协助精子穿过卵母细胞的放射冠和透明带。卵子受精的标志是在透明带和卵细胞膜间隙观察到__________。
(3)②过程的名称是__________，完成②过程后需对胚胎进行质量检查，这时的胚胎应发育到______________阶段。
(4)③过程用到的胚胎工程技术是__________________，它在胚胎工程中的意义在于__________________________________________。
解析：(1)
50
对供体和受体母畜需要进行同期发情处理，使两者处于相同的生理状态，以顺利完成胚胎移植和胚胎发育过程。精子可放在获能液中处理使精子获能，常用的获能液为肝素或钙离子载体A23187。(2)受精时，精子的顶体释放顶体酶发生顶体反应，从而使精子打开进入卵细胞的通道。卵细胞受精开始的标志是在卵细胞的透明带和卵黄膜间隙观察到两个极体。(3)②是冲卵，胚胎移植一般选择处于桑椹胚或囊胚时期的胚胎进行移植，此时的细胞还未分化或分化程度较低。(4)③过程常用胚胎移植技术，胚胎移植充分发挥了优良雌性个体的繁殖潜能。
答案：(1)同期发情 肝素(或钙离子载体A23187)
(2)顶体酶 两个极体 (3)冲卵 桑椹胚或囊胚
(4)胚胎移植 充分发挥雌性优良个体的繁殖能力
考向(二) 胚胎工程技术及应用
[真题导向]
1．(2018·江苏高考)下列关于采用胚胎工程技术实现某良种肉用牛快速繁殖的叙述，正确的是( )
A．采取激素注射等方法对良种母牛作超数排卵处理
B．体外培养发育到原肠胚期的胚胎即可进行移植
C．使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应
D．利用胚胎分割技术，同卵多胎较同卵双胎成功率更高
解析：选A 胚胎工程中，通常采用注射激素的方法对良种母牛进行超数排卵处理；体外培养发育到桑椹胚期或囊胚期的胚胎即可进行移植；受体母牛不会对移入子宫的外来胚胎发生免疫排斥反应，所以受体不需要使用免疫抑制剂；采用胚胎分割技术产生同卵双胎的成功率较高，而同卵多胎成功率很低。
2．(2017·江苏高考)牛雄性胚胎中存在特异性HY抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加HY单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列相关叙述正确的是( )
A．HY单克隆抗体由骨髓瘤细胞分泌
B．应选用原肠胚做雌雄鉴别
C．鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植
D．用HY抗原免疫母牛可获得相应抗体
解析：选D HY单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌；应选择囊胚期的滋养层细胞做雌雄鉴别；鉴别后的雌性胚胎才可用于胚胎移植；用HY抗原免疫母牛可获得相应抗体。
3．(2015·江苏高考)下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述，正确的是( )
A．乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养
B．细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行
C．采用胚胎分割技术产生同卵多胚的数量是有限的
D．培养早期胚胎的培养液中含维生素、激素等多种能源物质
50
解析：选C 正常乳腺中乳腺细胞不易分离培养，乳腺癌细胞在适宜条件下，具有无限增殖的特点，更易离体培养。细胞核移植不一定是在同种动物、同种组织的细胞之间进行，如可以将一种生物体细胞的细胞核移植到另一种生物去核的卵母细胞中。采用胚胎分割技术可以增加同卵多胚的数量，但分割胚胎的次数是有限的，一般是一分为二。培养液中的维生素和激素只能起调节作用，不能提供能量。
(1)胚胎移植的实质：早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换。
(2)两次使用激素的目的：
第一次：使供体和受体达到同期发情。
第二次：使供体超数排卵。
(3)“冲卵”的不同：
①胚胎移植过程中冲出的是早期胚胎。
②体外受精过程中冲出的是卵子。
(4)两次检查：第一次是对收集的胚胎进行检查；第二次是对受体是否妊娠进行检查。
(5)胚胎移植时期：桑椹胚或囊胚阶段。
[过关练习]
1．(2018·苏州调研)小鼠是现代生物科技中常用的实验材料。下列有关小鼠实验的叙述，正确的是( )
A．体外受精时，从卵巢中采集的卵子能直接与获能精子受精
B．利用小鼠制备单克隆抗体时，需要筛选出能产生特异性抗体的骨髓瘤细胞
C．胚胎分割过程中，可将囊胚的内细胞团均等分割产生的裸半胚直接移入受体
D．克隆小鼠时，需将供体细胞核移植至减数第二次分裂中期的次级卵母细胞中
解析：选C 体外受精时，从卵巢中采集的卵子，要在体外经人工培养成熟后，才能与获能精子受精；利用小鼠制备单克隆抗体时，需要筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞；胚胎分割过程中，可将囊胚的内细胞团均等分割，产生的裸半胚直接移入受体；克隆小鼠时，需将供体细胞核移植至减数第二次分裂中期的去核的次级卵母细胞中。
2．下列有关胚胎干细胞的叙述，正确的是( )
A．胚胎干细胞只能从桑椹胚或原始性腺中分离获取
B．胚胎干细胞的核仁明显，与其能旺盛合成蛋白质密切相关
C．胚胎干细胞在体外培养时只增殖不分化，因此没有应用价值
D．利用胚胎干细胞成功诱导产生神经细胞，体现了细胞的全能性
解析：选B 胚胎干细胞是从早期胚胎(如囊胚的内细胞团)或原始性腺中分离出来的；胚胎干细胞在体外培养时只增殖不分化，可以人为诱导分化，是研究体外细胞分化的理想材料；由于诱导产生的是神经细胞，未得到完整个体，故没有体现细胞的全能性。
50
3．下图表示利用胚胎干细胞(ES细胞)所做的一系列研究，过程Ⅰ是将带有遗传标记的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔，通过组织化学染色，用于研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响的因素。过程Ⅱ是将Gfp基因(绿色荧光蛋白基因)导入胚胎干细胞制备绿色荧光小鼠的过程。回答下列相关问题：
(1)图中所用的胚胎干细胞可以从囊胚的________或原始性腺中分离出来。过程Ⅰ的研究利用了胚胎干细胞具有________的特点。ES细胞在体外培养时培养液中添加____________能维持不分化的状态。
(2)Gfp基因和质粒中都存在Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 三种限制酶切割位点。过程①中应选用________和________两种限制酶对____________和____________________进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
(3)②过程常用的方法是________________，③过程为________。
(4)可以使用________________________法在蛋白质水平上鉴定小鼠是否存在绿色荧光蛋白。
解析：(1)胚胎干细胞是从内细胞团或原始性腺中分离出来的。过程Ⅰ是胚胎干细胞发育为胚胎的过程，利用了胚胎干细胞的全能性。体外培养时在培养液中添加抑制因子能够使胚胎干细胞维持不分化状态。(2)由图可知，BamH Ⅰ的识别序列在Gfp基因中，因而在构建重组质粒时，应选用Hind Ⅲ和SalⅠ两种限制酶对含Gfp基因的DNA和质粒进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。(3)将基因表达载体导入动物细胞常用显微注射法，③为将早期胚胎移植到受体的胚胎移植过程。(4)基因工程中在蛋白质水平的鉴定方法主要是抗原—抗体杂交法。
答案：(1)内细胞团 全能性 抑制因子 (2)SalⅠ HindⅢ 质粒 含Gfp基因的DNA (3)显微注射法 胚胎移植 (4)抗原—抗体杂交
考向(三) 生物技术的安全性及伦理问题
[真题导向]
(2013·江苏高考)下列关于转基因生物安全性的叙述中，错误的是( )
A．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
50
D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
解析：选B 我国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，要求对转基因生物产品及其加工品加贴标注，以方便消费者自主选择，但并非国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害，A项正确、B项错误；目前对转基因生物安全性的争论主要集中在转基因生物的食用安全性和环境安全性上，这些问题可以通过风险评估、预警跟踪和风险管理等措施得以解决，C、D项正确。
[过关练习]
1．(2018·江苏高考冲刺预测)下列关于生物技术安全性和伦理问题的叙述，错误的是( )
A．转基因植物的外源基因若来源于自然界，则不存在安全性问题
B．转基因植物合成的蛋白质可能成为某些人群新的过敏原
C．克隆人可冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念
D．运用重组基因技术可以将致病菌或病毒改造成威力巨大的生物武器
解析：选A 如转基因植物的外源基因来源于自然界，也存在安全性问题；转基因植物合成的蛋白质，可能成为某些人群新的过敏原；克隆人可冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念；运用重组基因技术可以将致病菌或病毒改造成威力巨大的生物武器。
2．(2018·江苏四校联考)下列属于对转基因生物安全性发生争论的原因的是( )
A．对基因的结构和调控机制等的了解仍相当有限
B．所转移的基因有不少是异种生物之间的基因转移
C．外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的
D．DNA重组技术需要有精心设计的“分子工具”
解析：选D 对基因的结构和调控机制等的了解仍相当有限，所转移的基因有不少是异种生物之间的基因转移，外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，这些都是对转基因技术存在争议的原因；在DNA重组技术中使用的“分子工具”包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体，人们可以根据需要选择使用，不是争论的原因。
3．(2018·扬州中学期中)下列关于生物技术的安全性及伦理问题的观点，错误的是( )
A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质
B．当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，但不反对治疗性克隆
C．反对设计试管婴儿的原因之一是因为试管婴儿技术属于无性繁殖方式
D．生物武器具有传染性强、作用范围广等特点，应严格禁止
解析：选C
50
严格选择转基因植物的目的基因，可避免产生对人类有害的物质，减少人们对转基因食物安全的担忧；当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，特别是生殖性克隆，但不反对治疗性克隆；反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿；生物武器有传染性强、作用范围广等特点，应严格禁止。
一、选择题
1．下列关于胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是( )
A．在动物的饲料中添加一定量的促性腺激素能促使其超数排卵
B．滋养层细胞发育成胎儿的胎膜和胎盘等结构的过程发生在囊胚期
C．若在囊胚期进行胚胎分割，内细胞团需均等分割
D．从动物体内获取的精子能直接与卵细胞结合完成受精过程
解析：选C 促性腺激素属于蛋白质类激素，在饲料中添加会因在动物的消化道中被分解而失去促进超数排卵的作用；滋养层细胞发育成胎儿的胎膜和胎盘等结构的过程发生在原肠胚期；若在囊胚期进行胚胎分割，需将内细胞团进行均等分割；从动物体内获取的精子需经过获能处理后，才能与成熟的卵细胞结合完成受精过程。
2．(2019届高三·常州四校联考)下列关于高等哺乳动物胚胎工程的相关叙述，错误的是( )
A．早期胚胎培养通常需要加入动物血清
B．胚胎干细胞具有体积小、细胞核大、核仁明显等特点
C．从动物体内获取的精子不能直接与卵细胞结合完成受精过程
D．胚胎移植可移植到其他任一经同期发情处理过的雌性哺乳动物体内
解析：选D 从动物体内获取的精子需要经过获能处理后才可以与卵细胞完成受精；胚胎应该移植到同种的、生理状态相同的雌性哺乳动物体内。
3．利用体细胞核移植技术得到的胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织器官后，可用于组织器官的移植，操作流程如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A．过程①所用的卵母细胞应培养至减数第二次分裂后期
B．过程②中细胞数目增加，所含有机物不变
C．过程③获取囊胚的滋养层，经过程④形成大量胚胎干细胞
D．完成过程⑤的根本原因是基因的选择性表达
50
解析：选D 过程①所用的卵母细胞应培养至减数第二次分裂中期；过程②中细胞进行分裂，数目增加，但细胞呼吸消耗有机物导致有机物减少；过程③获取囊胚内的内细胞团，经过程④可以形成大量胚胎干细胞；过程⑤是细胞分化，根本原因是基因的选择性表达。
4．下列有关生态工程的说法，错误的是( )
A．生态工程特点是少消耗、多效益、可持续
B．“桑基鱼塘”生态农业实现了物质和能量的多级循环利用
C．超载放牧导致草地退化，主要是违背了协调与平衡原理
D．在林业工程建设时要考虑整体性原理，防止“前面造林，后面砍树”
解析：选B “桑基鱼塘”生态农业实现了物质和能量的多级利用，但能量只能单向传递，不能循环。
5．下图为利用牛的乳腺细胞生产人体血清白蛋白的操作流程。有关叙述错误的是( )
A．细胞①中含有人体血清白蛋白基因
B．获取细胞②的技术为核移植
C．取囊胚期的内细胞团细胞作DNA分析，进行性别鉴定
D．试管牛与图示培育过程产生犊牛的生殖方式不相同
解析：选C 取囊胚期的滋养层作DNA分析，进行性别鉴定。
6．科学家先利用相关技术敲除猪受精卵内发育成某些器官的关键基因，再培养至囊胚期。将人的“诱导多能干细胞”注入猪囊胚中，移植到猪子宫内，取发育到21～28 d之间的胚胎，观察到了“不同程度的嵌合体”。下列相关叙述错误的是( )
A．本研究主要涉及基因工程、早期胚胎培养、胚胎移植等现代生物技术
B．“不同程度的嵌合体”中含有发育程度和所占比例不同的人组织
C．选择囊胚作为受体的主要依据是囊胚细胞没有分化，细胞具有发育的全能性
D．人猪嵌合胚胎研究为解决移植器官来源不足和免疫排斥问题带来光明前景
解析：选C 囊胚时期已经出现了内细胞团和滋养层的分化。
7．下列关于转基因生物安全性的叙述，错误的是( )
A．转基因生物的研究和利用不会对人类产生任何不利的影响
B．科学家应科学的认识、评估和利用转基因生物
C．社会公众在购买相关产品时享有知情权
D．转基因生物有可能被用于制造“生物武器”
解析：选A
50
转基因生物可能在食物安全、生物安全及环境安全等方面对人类产生不利影响；科学家应科学地认识、评估和利用转基因生物；社会公众在购买相关产品时享有知情权；转基因生物有可能被用于制造“生物武器”，例如可用重组基因技术制造全新的、人类没有接触过的致病菌。
8．下列有关生态工程的叙述，错误的是( )
A．农村综合发展型生态工程遵循了物质循环再生和整体性原理
B．我国南方的桑基鱼塘是运用系统整体性原理的典型实例
C．生态工程是一类少消耗、多效益、可持续的工程体系
D．“环境友好技术”及低污染清洁生产工艺可以减少城市污染的产出
解析：选B 农村综合发展型生态工程改善了农民的生活环境，实现了多种物质的循环利用，提高了经济效益，遵循了物质循环再生和整体性的原理；我国南方多水地区的桑基鱼塘模式体现了系统整体性及物质循环再生等多种原理；生态工程是一类少消耗、多效益、可持续的工程体系；推广“环境友好技术”和低污染清洁生产工艺，有利于减少污染的产出。
9．(2019届高三·南京六校联考，多选)下列关于胚胎工程理论及应用的叙述，错误的是( )
A．给优良母畜注射一定量的性激素从而达到超数排卵的目的
B．理论上胚胎干细胞能被诱导分化为机体内所有的细胞
C．若对囊胚进行胚胎分割，滋养层和内细胞团都需要均等分割
D．移植的胚胎只能来自体内受精或者体外受精直接产生的胚胎
解析：选ACD 给优良母畜注射促性腺激素可促进其超数排卵；对囊胚进行胚胎分割，内细胞团需要均等分割，而对滋养层的分割要求并不严格；移植的胚胎可来自体内受精、体外受精或核移植产生的胚胎。
10．(多选)下图表示利用二倍体小鼠所做的实验，有关叙述正确的是( )
A．过程①需运用早期胚胎培养技术
B．图中囊胚的细胞基因型都相同
C．代孕母鼠需进行同期发情处理
D．嵌合体幼鼠是四倍体
解析：选AC 过程①为体外胚胎培养，需运用早期胚胎培养技术；图中囊胚细胞来自两种不同的受精卵，基因型不一定相同；胚胎移植前代孕母鼠需进行同期发情处理；嵌合体幼鼠含两种不同的二倍体细胞，所以该个体是二倍体。
二、非选择题
11．下面是以医学手段培育“三亲婴儿”的技术路线图。
50
据图回答下列问题：
(1)由于女性的自然周期产生的卵子太少，捐献者在取卵前通常需要注射____________激素，促使一次有更多的卵泡发育。
(2)重组细胞需培养到MⅡ中期的原因是该时期的卵母细胞才具备________________。
(3)从受精卵到三亲婴儿的培育还需要_______________和___________________等技术。
(4)三亲婴儿的培育技术________(填“能”或“不能”)避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代，而___________(填“能”或“不能”)避免母亲的红绿色盲基因传递给后代。三亲婴儿的染色体______(填比例)来自母亲提供的细胞核。
(5)设计试管婴儿技术与为解决不孕夫妇的生育问题而出现的试管婴儿技术主要区别是植入前对胚胎进行___________________。
解析：(1)常用促性腺激素处理雌性个体以促进雌性个体超数排卵。(2)处于减数第二次分裂中期的卵母细胞才具有受精的能力，故培养卵母细胞需要培养到该时期。(3)体外受精后得到的受精卵需要进行早期胚胎培养，胚胎发育到桑椹胚或囊胚期时才可进行胚胎移植。(4)三亲婴儿的培育技术能避免母亲的线粒体遗传病基因传递给子代，因为子代的细胞质基因来自捐献者卵母细胞的细胞质。子代细胞核基因来自母亲和父亲，而红绿色盲基因位于细胞核中的性染色体上，故三亲婴儿的培育技术不能避免母亲的红绿色盲基因遗传给后代。三亲婴儿的染色体一半来自父方，一半来自母方。(5)设计试管婴儿需要在植入胚胎前对胚胎进行基因诊断，防止试管婴儿患病。
答案：(1)促性腺 (2)(与精子)受精的能力 (3)早期胚胎培养 胚胎移植 (4)能 不能 1/2 (或50%)
(5)遗传学诊断(或基因检测或基因诊断，合理即可)
12．治疗性克隆对解决供体器官缺乏和器官移植后免疫排斥反应具有重要意义。流程如下：
(1)过程①采用的是细胞工程中的________技术，过程②采用的是胚胎工程中的______________技术。
(2)体细胞进行体外培养时，所需气体主要有O2和CO2，其中CO2的作用是维持培养液(基)的________。
(3)如果克隆过程中需进行基因改造，在构建基因表达载体(重组载体)时必须使用
50
______________和______________两种工具酶。基因表达载体上除具有目的基因外，还需有________基因，以便选出成功导入基因表达载体的细胞。
(4)胚胎干细胞可以来自囊胚中的________。在一定条件下，胚胎干细胞可以分化形成不同的组织器官。若将图中获得的组织器官移植给个体________(填“A”或“B”)，则不会发生免疫排斥反应。
解析：(1)由流程图可知，个体A提供去核卵母细胞，个体B提供体细胞核，二者通过①得到重组细胞，重组细胞经②得到囊胚，故①是核移植，②是早期胚胎培养。(2)动物细胞培养时，要通入含有5%CO2的空气，CO2的作用是维持培养液的pH。(3)构建基因表达载体时，要用同种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶连接。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点、标记基因等，标记基因的作用是便于目的基因的检测和筛选。(4)囊胚中的内细胞团细胞为胚胎干细胞。图中获得的组织器官，其细胞的细胞核来自个体B，将所得组织器官移植给个体B，不会发生免疫排斥反应。
答案：(1)核移植 早期胚胎培养 (2)pH (3)限制酶 DNA连接酶 标记 (4)内细胞团 B
13．建设社会主义新农村的关键是构建和谐社会，发展生态农业，走可持续发展之路。下图为某地一生态工程建设模式图，请据图回答有关问题：
(1)生态经济是使一个系统产出的污染物，能够成为本系统或另一个系统的生产原料，从而实现废弃物的资源化。“无废弃物农业”体现了生态工程的________________原理。
(2)该生态工程模式的最大优点是_______________________________________________
____________________________。该生态工程种植不同的农作物、果树、苗木，饲养牛、猪、鸡等多种畜禽，这体现了生态工程的________________原理。
(3)该生态工程中，处于第二营养级的生物除鸡、奶牛、鱼外还有________(写全才可)，该生态工程建设中，鱼塘中每一种鱼苗的投放量都不宜超过其_______________________。
解析：(1)无废弃物农业体现的是物质循环再生原理。(2)
50
以沼气工程为中心的生态工程，用各类植物的秸秆、枝叶生产饲料养殖畜、禽、鱼，人、畜、禽的粪便作为原料生产沼气，最大的优点是充分利用了废弃物中的物质和能量，实现了物质和能量的分级多层次利用，同时又减少了环境污染。生态工程中，适当增加农作物、畜禽等生物种类，使生态系统营养结构复杂，自我调节能力增强，抵抗力稳定性增加，这体现了生态工程的物种多样性原理。(3)由题图可知，处于第二营养级的生物除鸡、奶牛、鱼外还有猪、人。鱼塘中养鱼时要考虑环境容纳量，投放的鱼苗量不能太多。
答案：(1)物质循环再生 (2)实现能量和物质的分层次多级利用(或提高物质和能量的利用率)，减少环境污染 物种多样性 (3)猪、人 环境容纳量(或K值)
_____________________________________________________
A卷——基础保分练
一、选择题
1．下列有关基因工程的叙述，正确的是( )
A．限制性核酸内切酶只在获得目的基因时使用
B．重组质粒的形成是在细胞内完成的
C．目的基因必须整合到受体细胞的DNA中才能复制
D．通过基因工程育种可以定向地改造生物的性状
解析：选D 构建基因表达载体时用同种限制酶切割目的基因和质粒；重组质粒是在细胞外构建完后再导入受体细胞的；重组质粒上有复制原点，不整合到受体细胞的DNA中也可复制；由于目的基因是已知的基因，所以可以定向地改变生物的性状。
2．下列关于核酸分子杂交和抗原—抗体杂交的叙述，正确的是( )
A．核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交
B．抗原—抗体杂交的原理为碱基互补配对原则
C．核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录
D．抗原—抗体杂交常以目的基因产物作为抗体
解析：选C 核酸分子杂交可以是两条脱氧核苷酸链的杂交，也可以是 DNA单链和RNA单链的杂交；抗原—抗体杂交的原理是抗体能与对应的抗原发生特异性结合；核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录；抗原—抗体杂交中目的基因产物常作为抗原。
3．白菜、甘蓝均为二倍体，若将白菜和甘蓝两者的花粉细胞的原生质体进行融合得到杂种细胞，再经植物组织培养获得“白菜—甘蓝”杂种植株幼苗。下列说法错误的是( )
A．培育出的“白菜—甘蓝”植株不能结子
B．该诱导融合过程一般使用灭活的病毒
C．该培育过程中的变异为染色体变异
D．该过程中需要向培养基中添加植物激素
解析：选B 白菜、甘蓝的花粉细胞中不含同源染色体，得到的“白菜—甘蓝”
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植株细胞内无同源染色体，不能产生正常生殖细胞，不能结子；灭活的病毒用于诱导动物细胞融合；植物细胞杂交的后代染色体数目与亲本不一致，为染色体数目变异；植物组织培养过程中需要向培养基中添加植物激素调节细胞的脱分化和再分化。
4．(2018·启东高级中学期末)下列有关植物细胞工程应用的叙述，错误的是( )
A．利用组织培养技术培育脱毒苗，获得具有抗病毒的新品种
B．利用组织培养技术获得人工种子，能保持亲本的优良性状
C．利用细胞培养技术获得紫草素，实现了细胞产物的工厂化生产
D．利用植物体细胞杂交技术获得“萝卜—甘蓝”，克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍
解析：选A 因为分生组织的病毒极少，甚至没有病毒，所以将分生组织(如根尖、茎尖)进行离体培养能获得脱毒植株，但不能获得抗病毒植株；经细胞培养技术产生的胚状体可直接制作“人工种子”，属于无性生殖，能保持亲本的优良性状；组织培养技术除了在农业生产上的应用外，还可广泛应用于细胞产物的工厂化生产，如利用细胞培养技术获得紫草素；白菜和甘蓝不属于同一物种，它们之间存在生殖隔离，因此利用植物体细胞杂交技术培育的“白菜—甘蓝”，能够克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍。
5．下图为培育甘蔗脱毒苗的两条途径，研究发现经②过程获得的幼苗脱毒效果更好。相关叙述错误的是( )
A．①过程所取茎尖中的叶原基具有较高的分裂、分化能力
B．②过程的作用可能是阻碍病毒等进入茎尖分生组织
C．③④过程中基因的选择性表达导致了细胞脱分化
D．培养基A、B中生长素和细胞分裂素的含量和比例不同
解析：选C ①过程取带叶原基的芽进行培养是因为芽具有较高的分裂和分化能力；②过程经过热水处理后脱毒效果好，与阻碍病毒进入有一定的关系；图中③和④均为再分化；一般情况下，生长素与细胞分裂素的比值高有利于分化出根，比值低有利于分化出芽，所以培养基A、B中生长素和细胞分裂素的含量和比例不同。
6．在动物细胞培养过程中，下列处理不恰当的是( )
A．提供种类齐全的营养物质
B．提供纯氧以保证细胞的呼吸作用
C．培养液和培养用具要进行无菌处理
D．提供适宜的温度和pH等环境条件
解析：选B 动物细胞培养所需的气体环境是95%的空气加5%的CO2。
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7．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是( )
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T淋巴细胞
B．②过程使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的所有特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群
解析：选D ①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应B细胞(浆细胞)；胰蛋白酶常用在动物细胞培养过程中，其作用是使组织分散成单个细胞，图示②过程应使用促融剂如聚乙二醇(PEG)；图示③为杂交细胞，但不一定是符合要求的杂交瘤细胞；图示④是经筛选获得的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
8．在核移植时，通常将整个体细胞而不是细胞核注入去核卵母细胞中，下列说法错误的是( )
A．体细胞太小因而获取细胞核较困难
B．细胞质中遗传物质少因而对遗传的影响很小
C．直接将体细胞注入卵母细胞简化了操作程序
D．体细胞的核离开了原来的细胞质将不能存活
解析：选D 体细胞太小，获取细胞核较困难，将整个体细胞注入去核卵母细胞中操作简单一些，且细胞质中遗传物质少，对遗传的影响很小。
9．下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是( )
A．卵裂期细胞的体积随分裂次数增加而不断增大
B．囊胚的滋养层细胞可发育成生物体的任何组织器官
C．动物胚胎发育的早期有一段时间是在透明带内进行的
D．培育试管婴儿涉及体内受精、早期胚胎培养和胚胎移植等
解析：选C 卵裂期细胞的体积随分裂次数增加而不断减小；囊胚的滋养层细胞可发育成胎盘和胎膜；动物胚胎发育的早期有一段时间是在透明带内进行的，因此孵化前的早期胚胎处于游离状态；培育试管婴儿涉及体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等。
10．供体的胚胎移植到受体后，游离的胚胎在发育过程中形成胎盘与受体相连，并通过胎盘与受体的血液发生物质交换。以下说法正确的是( )
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A．受体为供体胚胎发育提供条件
B．受体与胚胎血型应相同，否则会发生免疫排斥反应
C．受体与胚胎血液混融在一起
D．游离的胚胎心肺功能都能正常运转
解析：选A 受体对移植的胚胎不会发生免疫排斥反应；受体与胚胎血液不发生混融；游离的胚胎没有心肺器官。
11．“1＋1>2”体现的生态工程基本原理是( )
A．物种多样性原理
B．整体性原理
C．协调与平衡原理
D．系统学与工程学原理
解析：选D 系统各组分之间要有适当的比例关系，只有这样才能顺利完成能量、物质、信息等的转换和流通，并且实现总体功能大于各部分之和的效果，即“1＋1>2”。
12．(2018·扬州期末)通过转基因技术，人类培育了众多的转基因生物并开发了转基因食品。下列有关说法错误的是( )
A．转基因生物体内导入了外源基因
B．转基因食品一定对人类健康有害
C．转基因食品的营养成分不一定改变
D．我国十分重视转基因食品的安全性
解析：选B 转基因技术是将外源基因导入动植物体内，从而产生具有特定优良遗传性状的个体；目前，转基因食品是否安全，在科学上还没有定论；外源基因大多数是自然界已存在的基因，所以转基因食品的营养成分不一定改变；我国十分重视转基因食品的安全性。
13．(多选)下列有关基因工程相关工具的叙述，正确的是( )
A．限制酶能识别并切割DNA任意序列
B．DNA连接酶与Taq酶作用位点不同
C．没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞
D．使用质粒载体可以避免目的基因在受体内被分解
解析：选CD 限制酶具有特异性，能识别DNA上特定序列并在特定的位置上切割DNA分子；DNA连接酶与Taq酶作用位点都是磷酸二酯键；进入受体细胞的有普通质粒和重组质粒；质粒的特点之一是能够在宿主细胞内稳定存在，故将目的基因与质粒重组可以避免目的基因在受体内被分解。
14．(多选)下列有关细胞工程的叙述，正确的是( )
A．动物细胞培养时常用胃蛋白酶制备细胞悬液
B．植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性
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C．植物体细胞杂交获得的杂种植株含有两个亲本的遗传信息
D．单克隆抗体制备过程中对细胞进行多次筛选的目的和方法相同
解析：选BC 动物细胞培养制备细胞悬液常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织；单克隆抗体制备过程中第一次筛选是利用特定的选择培养基得到杂交瘤细胞，第二次及后面的多次筛选是利用抗原—抗体杂交筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
15．(2019届高三·南京、盐城联考，多选)梅花鹿属于单胎动物，季节性发情，育种工作者希望通过胚胎工程技术对优良品种进行扩大繁殖。下列有关叙述错误的是( )
A．给供体母鹿注射促性腺激素可使其一次排出多个卵子
B．培养早期胚胎的培养液中含有维生素、激素等多种能源物质
C．当受体数量有限时，可采用胚胎分割技术以获得更多的后代
D．梅花鹿的胚胎形成后一直处于游离状态，为胚胎收集提供可能
解析：选BCD 给供体母鹿注射促性腺激素可使其一次排出多个卵子；维生素、激素都不是能源物质；梅花鹿属于单胎动物，因此当受体数量有限时，无法通过胚胎分割技术以获得更多的后代；梅花鹿的胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态，这为胚胎的收集提供了可能。
二、非选择题
16．回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)
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为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
B卷——重点增分练
一、选择题
1．拟采用“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”的方法繁殖一种名贵花卉。下列有关叙述错误的是( )
A．消毒的原则是既要杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
B．在愈伤组织培养基中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞
C．出芽是外植体经细胞脱分化后再分化的结果，受基因选择性表达的调控
D．诱导分化生长物生根时，培养基中通常含有NAA等植物生长调节剂
解析：选B 愈伤组织细胞有细胞壁，加入细胞融合的诱导剂也不能使细胞融合；再分化出芽是基因选择性表达的结果；NAA等植物生长调节剂可以诱导分化生根。
2．(2019届高三·苏锡常镇四市调研)将鼠胚胎干细胞(ES细胞)种植于饲养层细胞上，添加干细胞因子、血小板生成素及动物细胞培养液，培养6 d后，检测发现86%的细胞形态与结构特征呈现出造血干细胞样细胞(CD34＋细胞)的特点。下列有关叙述错误的是( )
A．从早期胚胎中分离出来的细胞就是ES细胞
B．干细胞因子等物质可促进ES细胞分化形成CD34＋细胞
C．ES细胞形成CD34＋细胞的根本原因是基因的选择性表达
D．本实验结果尚不能支持“动物细胞具有全能性”的观点
解析：选A 从早期胚胎中分离出来的细胞有ES细胞，但不都是ES细胞；干细胞因子等物质可促进ES细胞分化形成CD34＋细胞；ES细胞形成CD34＋细胞的过程为细胞分化，其实质是基因的选择性表达；本实验结果只是形成了多种不同的细胞，并没有形成完整的个体，因此尚不能支持“动物细胞具有全能性”的观点。
3．下表是有关动物细胞培养与植物组织培养的比较，错误的是( )
选项
比较项目
动物细胞培养
植物组织培养
A
原理
动物细胞核的全能性
植物细胞的全能性
B
培养基
液体培养基
固体培养基
C
主要过程
原代培养，传代培养
脱分化，再分化，形成植株
D
主要运用
获得大量细胞或细胞产物
植物快速繁殖、获得脱毒苗等
解析：选A
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动物细胞培养是通过细胞分裂获得大量细胞或细胞产物，其原理是细胞增殖。
4.质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上的标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上生长情况也不同，图示外源基因在质粒中可插入的位置有a、b、c点。某同学根据实验现象对其插入的位点进行分析，其中分析正确的是( )
选项
实验现象
实验推论
在含青霉素培养基上生长情况
在含四环素培养基上生长情况
目的基因插
入的位置
A
能生长
能生长
a
B
不能生长
能生长
b
C
能生长
不能生长
c
D
不能生长
不能生长
c
解析：选B 根据题意和图示分析可知：a是抗四环素基因，如果外源基因插入到a中，会破坏此基因结构，使细菌在含有四环素的培养基上不能生长；b是抗青霉素基因，如果外源基因插入到b中，会破坏此基因结构，使细菌在含有青霉素的培养基上不能生长。
5．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列说法错误的是( )
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．构建基因表达载体时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，基因表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
解析：选B 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
6．下列关于基因治疗的说法正确的是( )
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A．基因治疗只能治疗一些传染病，如艾滋病
B．基因治疗的主要方法是让患者口服一些健康的外源基因
C．基因治疗的主要原理是引入健康基因并使之表达
D．基因治疗在发达国家已成为一种常用的临床治疗手段
解析：选C 基因治疗是治疗遗传病的有效手段；基因治疗的主要方法是把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中，口服外源基因不能起作用；基因治疗的主要原理是引入健康基因并使之表达，以治疗患者因基因缺陷导致的疾病；目前，基因治疗还处于初期的临床试验阶段。
7．下图表示牛胚胎移植的流程，其中①～④表示相应的操作过程。相关叙述错误的是( )
A．过程①注射相关激素，使供、受体同期发情
B．过程②注射促性腺激素，达到超数排卵的目的
C．过程③主要涉及人工授精和从卵巢中冲取胚胎
D．过程④的主要目的是选择适合移植的胚胎
解析：选C 过程③主要涉及人工授精和从子宫中冲取胚胎。
8．下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是( )
A．卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加
B．滋养层细胞发育成胎膜和胎盘是在囊胚期
C．在胚胎移植时，受体母畜必须经过免疫学检验以防止排斥外来胚胎
D．胚胎干细胞是一类未分化细胞，可从早期胚胎中分离获取
解析：选D 卵裂期胚胎中有机物总量不断减少；滋养层细胞发育成胎膜和胎盘是在囊胚期之后；胚胎移植时，不必进行免疫学检验。
9．“无废弃物农业”是生态工程最早的模式之一。如图是无废弃物农业中对有机废弃物进行处理的一种方案。下列有关叙述错误的是( )
A．“物质循环再生”是“无废弃物农业”遵循的主要生态学原理
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B．施用有机肥能为作物提供更多的营养物质和能量
C．从资源化、无害化角度分析，途径②③优于④
D．通过蚯蚓、沼气池中的微生物等分解者能有效地促进系统中物质的循环利用
解析：选B 有机肥经过分解可以为作物提供更多的营养物质，但不能为作物提供能量，农作物利用的能量是光能；从资源化、无害化角度分析，途径②③可以得到更多产品，产生沼气等能源，途径④只能产生电能、热能，且有污染；通过蚯蚓、沼气池中的微生物等分解者的分解作用能有效地促进系统中物质的循环利用。
10．(2017·南通二模，多选)限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为G↓GATCC和A↓GATCT。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并连接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是( )
A．酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素
B．目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是—CTAGG
C．分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向插入质粒
D．经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别
解析：选AD 由于酶的浓度、温度、反应时间等会影响酶促反应速率，所以操作时要控制好相关条件；BamHⅠ切割形成的黏性末端是—CTAG；由于两种限制酶切割形成的黏性末端相同，故不能保证目的基因的定向插入；用DNA连接酶连接后的碱基序列发生改变，故不能再被这两种酶识别。
11．(2018·泰州中学模拟，多选)青蒿素是从植物黄花蒿的叶片中所提取的一种代谢产物，而茎及其他部位中的青蒿素含量及其微小。下列关于利用植物组织培养生产青蒿素的叙述，正确的是( )
A．在黄花蒿组织培养过程中的一定阶段必须给予光照
B．加入大量生长素可提高青蒿素的产量
C．可通过大量培养愈伤组织以直接获得青蒿素
D．可大规模栽培组织培养苗以获取药用成分
解析：选AD 植物组织培养包括脱分化和再分化两个过程，其中脱分化过程不需要光照，再分化过程需要光照；生长素对脱分化和再分化过程具有调节作用，但加入大量生长素可能不利于组织生长，不能提高青蒿素的产量；青蒿素是从植物黄花蒿的叶片中所提取的一种代谢产物，茎及其他部位中的青蒿素含量及其微小，因此通过大量培养愈伤组织不能直接获得青蒿素；可大规模栽培组织培养苗以获取药用成分。
12．(多选)下列关于生物技术的叙述，正确的是( )
A．烟草叶片可离体培养产生新个体，小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖
B．动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养可用于植物脱除病毒
C．目的基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间，才能进行转录
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D．目的基因与荧光标记的DNA探针进行分子杂交，能形成磷酸二酯键
解析：选ABC 植物细胞具有全能性，烟草叶片离体培养能产生新个体；小鼠杂交瘤细胞可以在体外培养条件下无限增殖，因此小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖。动物细胞培养可以用于检测有毒物质，茎尖(几乎不含病毒)培养可用于植物脱除病毒。目的基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行转录。目的基因与荧光标记的DNA探针按碱基互补配对进行分子杂交，配对的碱基间形成氢键。
二、非选择题
13．2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指______________________
________________________________________________________________________。通过核移植方法获得的克隆猴，
与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目________(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度________(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是_________________
________________________________________________________________________。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目________(填“相同”或“不同”)，性染色体组合________(填“相同”或“不同”)。
解析：(1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。将重组细胞形成的早期胚胎移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞与提供细胞核的个体的体细胞的染色体数目相同。(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植获得克隆动物的难度明显高于胚胎细胞核移植。(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目相同，性染色体组合不同。
答案：(1)将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中 不变 (2)小于 胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易 (3)相同 不同
14．人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。口服α干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题：
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(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是________________________________________________________________________。
科研人员还在两种引物的一端分别加上____________和____________序列，以便于后续基因的剪切和连接。
(2)过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________，过程③中需先用________处理根瘤农杆菌，以便将基因表达载体导入细胞。
(3)过程④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________过程获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是________________________
________________________________________________________________________。
(4)科研人员认为，将转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好，其依据是____________________________________。
解析：(1)PCR技术的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，因此合成引物时主要依据目的基因(干扰素基因)两端的部分核苷酸序列。同时为便于后续的剪切和连接，设计引物时还需加上相关限制酶的识别序列，本题中两种限制酶的识别序列分别是GAATTC、GGATCC。(2)基因表达载体的组成有目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。用原核细胞作为受体细胞时，常用Ca2＋处理，使其成为感受态。(3)从愈伤组织细胞提取RNA后，经逆转录获得DNA。利用PCR技术获得较多的DNA片段进行检测筛选，若不能检测出干扰素基因，说明在愈伤组织细胞中不含干扰素基因转录形成的RNA，可能是干扰素基因未能导入，也可能是导入的干扰素基因未转录。(4)单纯干扰素只起治疗的作用，而转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物既有干扰素的治疗作用，又有人参的滋补作用。
答案：(1)干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC (2)复制原点 Ca2＋ (3)逆转录 导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录(或干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞) (4)药物既有干扰素治疗的作用，又有人参的滋补作用
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