基因工程和克隆技术
一、选择题
1．(2019届高三·南京六校联考)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，
对降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是( )
解析：选C 根据电泳图可知KpnⅠ 切割只得到1种DNA片段，判断该DNA分子是环状，且该DNA分子上只有1个KpnⅠ 切点。EcoRⅠ 切割得到2种DNA片段，说明该DNA分子上有两个EcoRⅠ 切点。据此分析选项中的酶切图谱，只有C项符合。
2．中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境。下列说法错误的是( )
A．该工程可以定向改变蛋白质分子的结构
B．改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的
C．改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种
D．改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
解析：选D 蛋白质工程通过对基因进行人工合成或修饰，最终定向改变蛋白质分子的结构；改造后的中华鲟遗传物质变化不大，和现有中华鲟不存在生殖隔离，仍是同一物种；改造后的中华鲟含有控制新蛋白质合成的基因，所以后代具有改造的蛋白质。
3．(2018·江苏六市二模)农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的运载体，下列相关叙述正确的是( )
A．Ti质粒是能够自主复制的单链DNA
B．Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接
C．重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞
D．Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上
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解析：选B Ti质粒是能够自主复制的环形双链DNA分子，其分子内部的磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接。重组Ti质粒的受体细胞可以是植物愈伤组织细胞，也可以是其他的植物细胞，如植物的受精卵细胞。农杆菌有Ti质粒，Ti质粒上有一段TDNA，目的基因需插入Ti质粒上的TDNA中形成重组质粒载体，再导入农杆菌，然后让含重组质粒载体的农杆菌侵染植物，只有Ti质粒上的TDNA片段(内有目的基因)而不是Ti质粒上的全部基因整合到受体细胞染色体上。
4．下列关于人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( )
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均始于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可以将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．表达载体中的启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
解析：选C 胰岛素基因在人体肝细胞中不表达，所以从肝细胞中不能提取到胰岛素基因转录成的mRNA；基因的表达始于启动子，基因的复制始于复制原点；抗生素抗性基因作为标记基因，可以将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来；启动子是转录的起点，终止密码子是翻译的终点。
5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( )
A．动物细胞培养过程中往往使用液体培养基
B．动物细胞培养的目的是为了培养动物个体
C．在培养过程中通常要通入5%的CO2刺激细胞呼吸
D．动物细胞培养过程中可用胃蛋白酶将动物组织分散成单个细胞
解析：选A 动物细胞培养的目的是为了获得细胞群或细胞产物；动物细胞培养过程中通常要通入5%的CO2的作用是维持培养液的pH；动物细胞培养过程中用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将动物组织分散成单个细胞。
6．植物细胞工程作为一门新兴的生物技术，被广泛应用于社会生产，下列说法错误的是( )
A．人工种子是用人工薄膜为种皮包被植物愈伤组织形成的
B．植物微型繁殖运用了植物组织培养技术，可快速繁殖良种植物
C．作物脱毒常选取植物的茎尖，因为该处病毒较少或无病毒
D．植物细胞融合中常用的融合手段有离心、振动、电激和PEG法
解析：选A 人工种子常使用人工薄膜作为种皮包被胚状体。
7．(2018·江苏四校联考)下列关于植物组织培养及其应用的叙述，正确的是( )
A．离体的植物组织、器官必须经过灭菌才能接种到组织培养基中
B．以植物芽尖为材料通过组织培养可以获得抗毒新品种
C．生长素、细胞分裂素的调节作用在组织培养中非常重要
D．以人工膜包裹植物愈伤组织和营养物质可制得人工种子
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解析：选C 离体的植物组织、器官必须经过消毒(灭菌会杀死植物组织和器官)才能接种到组织培养基中；以芽尖为材料通过组织培养可以获得脱毒苗，但不属于新品种，抗病毒的新品种需通过转基因技术获得；生长素、细胞分裂素调节作用在组织培养中非常重要；以人工膜包裹胚状体和营养物质可制得人工种子。
8．下列关于动物细胞培养技术的叙述，错误的是( )
A．生物组织经胰蛋白酶消化处理制成细胞悬液，再培养可获得单层细胞
B．研究中使用的细胞通常培养至10代以内，以保持正常的二倍体核型
C．为防止杂菌污染，生物组织、培养液及培养用具需要进行灭菌处理
D．动物细胞培养是制备单克隆抗体、细胞核移植、胚胎工程等技术的基础
解析：选C 生物组织灭菌处理后会死亡，无法培养，生物组织通常做消毒处理。
9．(2018·扬州一模，多选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列有关叙述正确的是( )
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②利用PCR扩增CarE基因需使用解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
解析：选AD 利用PCR扩增基因时，通过高温使DNA解旋，不需要解旋酶，但需要耐高温的DNA聚合酶；用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。
10．(多选)超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，具有延缓衰老的功效。下图为培养转SOD基因胡萝卜新品种的过程，相关叙述正确的是( )
A．过程①通常采用显微注射法将携带SOD基因的Ti质粒导入细胞
B．过程②③除培养基中所含激素比例不同外，其他条件完全相同
C．将愈伤组织分散成单个细胞，通过细胞培养也可能获得大量SOD
D．该育种方式获得的转基因胡萝卜自交后代可能会出现性状分离
解析：选CD 植物基因工程中，目的基因导入受体细胞的常用方法是农杆菌转化法；在植物组织培养过程中，脱分化(②)和再分化(③)阶段使用的培养基除植物激素的比例不同外，营养物质的含量也不完全相同，并且脱分化阶段不需要光照，再分化阶段需要光照。
二、非选择题
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11．如图是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病(基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素)的过程图解，请据图回答下列问题：
(1)图中①结构表示________，选择____________(时期)的卵母细胞去核后作为受体细胞构建重组细胞A。
(2)②所示的细胞是________________，将健康胰岛素基因导入②中的常用方法是________________。
(3)在培养液中加入______________可诱导重组细胞B定向分化形成具有正常胰岛B细胞功能的胰岛样细胞，其根本原因是______________________________________________。
(4)图示方法与一般的异体移植相比最大的优点是______________________________。
解析：(1)分析图解可以看出，重组细胞A的形成利用的是体细胞核移植技术，故图中①结构表示细胞核，应选择处于MⅡ中期的卵母细胞去核后作为受体细胞构建重组细胞A。(2)②是囊胚中的内细胞团细胞或胚胎干细胞，具有发育的全能性，将含目的基因表达载体导入动物细胞常用的方法是显微注射技术。(3)重组细胞B在一定的分化诱导因子的定向诱导作用下，可以定向分化形成具有正常胰岛B细胞功能的胰岛样细胞，其根本原因是基因的选择性表达。(4)图示方法属于基因治疗，由于输入患者体内的细胞是由患者自身的细胞分化而来，所以与一般的异体移植相比，该方法最大的优点是不会发生免疫排斥反应。
答案：(1)细胞核 MⅡ中期(减数第二次分裂中期) (2)内细胞团细胞(或胚胎干细胞) 显微注射技术
(3)分化诱导因子 基因的选择性表达 (4)没有免疫排斥反应
12.科学家发现细菌细胞中存在清除入侵病毒DNA的功能系统(图1)，并发明了CRISPR/Cas9基因编辑技术，目前已成为生物科学领域最热门的基因操作技术。图2 是科研人员运用CRISPR/Cas9基因编辑技术(其中表达载体1的作用是在受体细胞中控制合成CRISPR复合体，表达载体2可以与相应DNA的同源区进行互换、重组)，成功地将基因A精确导入到绒山羊细胞内的甲、乙两个基因之间，并和绿色荧光蛋白基因一起表达的过程示意图。请回答下列问题：
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(1)由图1可知，CRISPR复合体中crRNA的主要功能是__________________________，而Cas9蛋白催化断裂的化学键位于________________之间。细菌的这种清除能力的生理意义是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)结合对图1的理解，图2中表达载体1首先要表达出含有__________________________序列的crRNA和Cas9蛋白，以结合形成CRISPR复合体。
(3)根据图2，基因表达载体2上需要加入：①基因甲片段、②基因乙片段、③基因A、④绿色荧光蛋白基因等四种DNA片段，这4种片段在载体上的正确排列顺序应是_______(用序号代表相应片段)。在形成重组DNA时需要___________酶参与催化表达载体2与绒山羊DNA的连接。
(4)实验室一般会将重组DNA导入山羊的胚胎干细胞中，以培育、筛选出转基因山羊，选择胚胎干细胞作为受体细胞的主要依据是_______________________________________。
(5)与传统的基因工程相比较，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物的明显优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)由图1可知，crRNA是由DNA的特定区段转录形成的，由此可推知，CRISPR复合体中crRNA的主要功能是识别DNA分子上的特定核苷酸序列；CRISPR复合体能催化水解噬菌体DNA，由此可推知CRISPR复合体中的Cas9蛋白催化断裂的化学键位于磷酸和脱氧核糖之间；细菌的这种清除能力可防止外源基因插入并表达，保证了细菌遗传性状的稳定。(2)据图2可知，表达载体1表达出的CRISPR复合体可以切割基因甲和基因乙之间的DNA片段，所以结合对图1的理解，可推知图2中表达载体1首先要表达出含有基因甲与基因乙之间部分核苷酸序列的crRNA和Cas9蛋白，以结合形成CRISPR复合体。(3)根据图2重组DNA中各基因片段的排列顺序，可推知这4种片段在基因表达载体2上的正确排列顺序应是①③④②；在形成重组DNA时需要DNA连接酶参与催化表达载体2与绒山羊DNA的连接。(4)要培育、筛选出转基因山羊，选择胚胎干细胞作为受体细胞的主要依据是胚胎干细胞具有发育的全能性。(5)与传统的基因工程相比较，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物的明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
答案：(1)识别DNA分子上的特定核苷酸序列 磷酸和脱氧核糖 防止外源基因插入并表达，保证了细菌遗传性状的稳定 (2)基因甲与基因乙之间部分核苷酸 (3)①③④② DNA连接 (4)胚胎干细胞具有发育的全能性 (5)避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题
13．RTPCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示：
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(1)过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、_________________、____________和引物A等。
(2)进行过程Ⅱ前首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是_________________
_______________________________________________________，该反应体系中所用的Taq酶至少应能耐受__________℃高温。
(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要________个引物B。
(4)利用RTPCR技术获取的目的基因______________(填“能”或“不能”)在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是________________________________________________________________________。
(5)RTPCR过程中主要借助对________的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
解析：(1)过程Ⅰ是由mRNA形成cDNA的过程,示逆转录,要加入缓冲液、原料、RNA提取物、逆转录酶和引物A等。(2)进行过程Ⅱ前首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是让逆转录酶变性失活、使mRNAcDNA杂合双链解开，该反应体系中所用的Taq酶至少应能耐受95 ℃高温。(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要2n－1个引物B。(4)利用RTPCR技术获取的目的基因能在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测。(5)RTPCR过程中主要借助对温度的控制，影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
答案：(1)RNA提取物 逆转录酶 (2)让逆转录酶变性失活、使mRNAcDNA杂合双链解开(答出一点即可) 95 (3)2n－1 (4)能 增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测 (5)温度
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